苯酚-硫酸法测定桂花叶中多糖的研究

林志銮 陈培珍

（武夷学院 福建省高校绿色化工技术重点实验室，福建省 武夷山 354300）

苯酚-硫酸法测定桂花叶中多糖的研究

林志銮 陈培珍

（武夷学院 福建省高校绿色化工技术重点实验室，福建省 武夷山 354300）

建立测定桂花叶中多糖含量的方法。采用苯酚-硫酸法，分别考察该方法的测定波长、精密度、准确度及稳定性。结果表明，测定波长为490 nm，多糖得率达11.35%，线性方程为Y=8.82012*X-0.13，线性相关系数r=0.9997，精密度为RSD%=2.28%(n=6)，平均标准回收率为98.55%。该方法为桂花叶多糖的测定提供了一种快速简便的技术。

桂花；提取；苯酚 -硫酸法

多糖已作为有生物活性的天然产物中的一个重要类型出现，具有的抗肿瘤、免疫、抗凝血、降血糖和抗病毒等多种生物活性、毒副作用小和不易造成残留等优点活性已相继被发现[1，2，3]，所以近年来多糖成为天然药物研究的热点[4，5，6，7，8]。桂花（Osmanthus fragrans lour)又名木犀、九里香、金栗是我国十大传统名花之一，桂花富含蛋白质、脂肪、碳水化合物等，被称为“全营养食品”[9，10]。关于桂花叶多糖成分的提取及含量测定的研究尚未见报导。本文用水溶醇析法提取了桂花叶多糖，并采用硫酸-苯酚法[11]对其多糖含量进行了较详细的研究，为桂花的深度开发应用提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

葡萄糖 A.R.；苯酚 A.R.；硫酸 A.R.；无水乙醇 A.R.；石油醚 A.R.；氯仿 A.R.；正丁醇 A.R.。桂花叶来自福建武夷山地区，自然晒干，烘至恒重备用。

标准葡萄糖溶液的配制：在105℃烘干至恒重的葡萄糖，精确称取0.2000g定容到100mL，即为2.0mg·mL-1的标准葡萄糖溶液。

紫外可见分光光度计UV-2550（日本岛津），恒温水浴锅（常州国华），分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司），真空干燥箱（上海精宏），自动纯水蒸馏器（上海嘉鹏科技有限公司），微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器厂）。

1.2 实验方法

1.2.1 桂花多糖的提取工艺流程：桂花干叶→粉碎、过筛(60目)→乙醇索氏提取回流至无色→残渣晾干→水浴浸提4小时→减压过滤→sevage法脱蛋白→剧烈震荡→静置分离→浓缩至15mL左右→乙醇沉淀→减压过滤→丙酮溶剂洗涤3次→低温干燥→桂花多糖(备用)

1.2.2 葡萄糖工作曲线的制作：采用苯酚-硫酸法[11]进行测定。

1.2.3 总还原糖含量的测定：将桂花叶多糖浓缩液移到25mL容量瓶中，加蒸馏水定容；取1.0mL该溶液和1.0mL蒸馏水于25mL比色管中，加入6%的苯酚1.0mL，快速加入98%的浓硫酸5.0mL，静置10min后摇匀，冷却至室温，然后在490nm波长处比色，通过葡萄糖质量浓度（mg·mL-1）和吸光度（A ）进行回归，计算桂花叶多糖含量及多糖提取率。

提取率 (%)=总还原糖含量 (g)/原料干重 (g)×100%

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的确定

空白溶液调零后，对葡萄糖标准溶液和桂花叶多糖混合溶液（a），桂花叶多糖溶液（b）标准葡萄糖溶液（c）进行200-800nm扫描，结果经比较分析后，取干扰较少、测定稳定且灵敏度较高的490nm作为测定波长。如图1所示。

如图1为最大吸收波长的确定

2.2 工作曲线的绘制

葡萄糖标准曲线的绘制：称取葡萄糖0.2000g于100mL容量瓶中定容,即为2.0mg·mL-1葡萄糖标准溶液，取2.0mL蒸馏水作为空白样，依次取0.4、0.8、1.2、1.6、1.8、2.0mL葡萄糖标准溶液,用蒸馏水补足2.0mL，在7个样品中加入1.0mL 6%的苯酚，5.0mL 98%的浓H2SO4，静置10min后摇匀，流水冷却到室温，定容到25mL。然后在490nm波长处比色。实验表明，在0.016mg·mL-1～0.160mg·mL-1范围内，吸光度（A）与葡萄糖浓度成良好的线性关系Y=8.82012*X-0.13，R=0.9997。

2.3 检出限的确定

另外，对 0.016、0.032、0.064 mg·mL-1葡萄糖标准溶液进行6次重复测定，求出每个浓度水平的标准偏差s1、s2、s3，并对三个标准偏差和浓度进行线性回归分析，得回归方程S=-0.3094*X+0.00336。当X=0时，求得S0=0.00336，3倍的S0即为该方法的最小检测限。

表1 苯酚硫酸法方法检出限确定

2.4 精密度试验

在上述条件下，准确移取桂花叶多糖样品1.0mL，平行测定6次，计算6次结果的相对标准偏差，RSD%=2.28%。表明该方法测定桂花叶多糖精密度良好。

2.5 重现性试验

上述试验条件下，精密称取同一批桂花叶6份，测定桂花叶多糖的吸光度，计算6次结果的相对标准偏差，RSD%=3.11%。表明该方法测定桂花叶多糖重现性良好。

2.6 样品加标回收率试验

精确移取1.0 mL桂花叶多糖样品6份，其中1份为对照，5份分别再准确移取2.0mg·mL-1标准葡萄糖样品1.0mL，在上述条件下进行测定。其样品加标回收率在92.55%～114.25%之间。平均值为：98.55%，RSD%=4.77%。

表2 桂花叶多糖样品加标回收率确定

2.7 显色条件的确定

2.7.1 显色时间的影响

吸取多糖浓缩液移到25mL容量瓶中，加蒸馏水定容；取1.0mL该溶液和1.0mL蒸馏水于25mL比色管中，加入6%的苯酚1.0mL，混匀，快速加入98%的浓硫酸5.0mL，改变静置时间，流水冷却至室温，然后在490nm波长处比色，测定吸光度,结果见图2。由图2可知，在5 min到30 min显色较稳定，可见时间对显色的影响不大，10 min吸光度达到最大，故显色时间选择10min为宜。

图2 显色时间对吸光度的影响

2.7.2 苯酚用量的影响

改变苯酚用量，他条件同2.7.1，测定吸光度，结果见图3。由图3可知，当苯酚用量达到1.0mL后。吸光度变化相对较小，故选择1.0mL为宜。

图3 苯酚用量对吸光度的影响

2.7.3 硫酸用量的影响

改变硫酸用量，他条件同2.7.1测定吸光度,结果见图4。由图4可知,随着硫酸用量增大,其吸光度也越大，但随着硫酸的用量增加，吸光度变化率增加减少，故选择硫酸用量是5.0mL为宜。

图4 硫酸用量对吸光度的影响

3.2 样品测定

精确称取桂花叶粉末0.5000g，按照1.2.1提取流程进行提取样品，最后将提取出来的桂花叶多糖定容到25 mL，准确移去1.0ml该提取液，按照1.2.3方法进行测定，平行5次.（结果见表3）

表5 桂花叶多糖提取与含量测定

4 结论

本实验采用水提醇析的方法提取了桂花叶中多糖，采用硫酸-苯酚法进行了糖含量测定，结果测得桂花叶多糖含量为11.35%，精密度为RSD%=2.28%(n=6)，平均标准回收率为98.55%。从实验结果可以看出，用硫酸-苯酚法测定多糖含量，结果相对标准偏差较小，实验结果重现性较好，所得数据准确。

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Determination of Polysaccharide from Leaves of Osmanthus Fragrans Lour.by Phenol-Sulfuric Acid Method

LIN Zhiluan CHEN Peizhen

（Key Laboratory for Green chemical in Chemical Engineering and Technology specialty of Fujian Higher Education，Wuyi College，Wuyishan，Fujian 354300）

The assay of determination of polysaccharide content in leaves of Osmanthus fragrans Lour.was built.By phenol-sulfuric method,determination wavelength,precision,accuracy and stability were discussed.The results showed that the measure wavelength was 490 nm,the polysaccharide content of leaves of Osman thus fragrans Lour.was an average of 11.35%,The linear equation was Y=8.82012*X-0.13,and the correlation coefficient was0.9997 .RSD was 2.28%(n=6)and the average recovery was 98.55%.This method provided a quick and convenient technique for the determination of polysaccharide from leaves of Osmanthus fragrans Lour.

osmanthus fragrans lour；extraction；phenol-sulfuric acid method

R284.2

A

1674－2109(2011)05－0044－04

2011-09-09

武夷学院校科研基金海西项目 （基金项目：XH201002）；武夷学院对接南平市产业发展科研专项（基金项目：2011DJ10）。

林志銮（1981-），男，汉族，硕士，助理实验师，主要研究方向：天然产物提取分离。