分子排阻色谱法测定云芝糖肽的分子量分布

高 平

（江苏江山制药有限公司，江苏靖江 214500）

分子排阻色谱法测定云芝糖肽的分子量分布

高 平

（江苏江山制药有限公司，江苏靖江 214500）

目的建立分子排阻色谱法测定云芝糖肽的分子量分布的方法。方法用分子排阻色谱法，色谱柱：TS Kgel G4000S W（7.5mm×300mm）柱，流动相：0.02mol/L醋酸钠溶液，柱温：30℃,已知分子量右旋糖酐分子量标准品作校正标准，示差折光检测器。流速：0.50mL/min；进样量：10μL。结果根据建立的方法测定，分析了3批样品，得到云芝糖肽的排阻色谱图并计算出重均分子量大于40000的相对百分比为59.7%，63.6%，66.6%。结论该方法简便、快速，可用云芝糖肽的质量控制。

云芝糖肽；分子排阻色谱法；分子量分布；测定

云芝糖肽（Posaverptidum,简称PSP）系从多孔菌科植物云芝（Coriolusversicolor L．ex．Fr．）Quel．（菌株Cov-1）的菌丝体中提取的高分子糖肽聚合物，主要活性成分是结合蛋白多糖（Proteoglycan），作为一种有效的生物效应调节剂，应用于肿瘤的治疗，增强人体免疫功能的作用[1]。云芝糖肽的免疫激活活性与其分子量分布密切相关，分子量小于4000时几乎没有活性，该品重均分子量大于4万的不少于50%。应用高效分子排阻色谱法[2-3]测定了云芝糖肽的分子量分布，为考察工艺的稳定性及快速控制产品质量提供了依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国Agilent公司1100型）；示差折光检测器，（Agilentchemstation，Rev.A10.02,GPC Dateanalysiss of tware，Rev.A 02.02）；电子分析天平（赛多利斯BP211D）；LD4-2A离心机（北京医用离心机厂）；Anke TGL-16c高速离心机（上海安亭科学仪器厂）；十种右旋糖酐分子量标准品（中国药品生物制品检定所，批号：140637-2000-01）；醋酸钠为色谱纯（美国dionex公司）；葡萄糖和乙醇均为国产分析纯；蓝色葡聚糖为S I G M A公司试剂；实验用水为二次重蒸水；云芝糖肽样品3批（江苏华信制药有限公司生产，批号为100701，100702，100703）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：TS KgelG4000S W（7.5mm×300mm）柱；流动相：0.02m o l/L醋酸钠溶液；柱温：30℃；流速：0.50mL/min；进样量：10μL；数据采集时间：60min。

2.2 系统适用性试验

理论板数：精密称取葡萄糖10mg，至10mL容量瓶中，加流动相溶解，并定容至刻度，得1mg/mL的溶液，按“2.1色谱条件”进样，记录色谱图。凝胶色谱柱按葡萄糖峰计理论板数由色谱工作站直接读出Plates=14635。分配系数（K d） 计算：取葡萄糖、蓝色葡聚糖、供试品适量，分别加流动相制成每1mL约含10mg的溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，按“2.1色谱条件”进样，记录色谱图。结果样品主峰K D＝（tR-t 0）/（tT-t0）=0.63，KD在0～1之间，符合分子量测定要求。式中tR为供试品主峰保留时间，t0为蓝色葡聚糖峰保留时间，tT为葡萄糖峰保留时间。

2.3 标准曲线绘制

采用已知分子量的右旋糖酐分子量标准品，根据样品分子量的大小，选用重均分子量（MW）为10000，21400，41100，84400，133800的5个标准品制备标准曲线。分别取标准品适量，加流动相制成10mg/mL的溶液。取标准品溶液分别用0.45μm微孔滤膜过滤，进样10μl，记录色谱图，用G P C软件以右旋糖酐对照品重均分子量对数值lg MW对保留时间t R进行回归处理，标准曲线 （见图 1），回归方程：Lg Mw＝7.5161-0.16129tR，相关系数为r=-0.99675，具有良好的线性关系。

图1 GPC校正曲线

2.4 样品处理

取样品2.0g，加水50mL充分溶解，以3000转/分离心15分钟，取上清液40mL，分三次加入乙醇60mL，摇匀，在4℃放置1小时，以4000转/分离心15分钟，取出沉淀物在80℃干燥4小时。干燥沉淀物用玛瑙研钵研细，取适量，精密称定，用流动相溶解并制成每1mL中约含10mg的溶液，以10000转/分钟高速离心10分钟，用5mL注射器吸取上清液，经0.45μm微孔滤膜过滤后待进样。

2.5 精密度考察

取批号为100701供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，连续测定6次，根据G P C曲线计算重均分子量（M W） 大于40000的百分比为59.7%、60.0%、59.8%、59.2%、60.2%、60.3%，R S D为0.60%，表明该系统精密度良好，仪器连续进校误差较小，符合《中国药典》的要求。

2.6 重复性试验

取批号为100701的样品，按“2.2”项下分别制备供试品溶液6份，按“2.1”项下色谱条件测定分子量分布，根据G P C曲线计算重均分子量 （M W） 大于40000的百分比为59.7%、60.6%、59.6%、60.6%、60.2%、59.6%，R S D为0.67%，表明该分析方法测定样品分子量的重复性良好。

2.7 稳定性考察

取批号为100701供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件在0、4、8、12、16、20、24小时分别测定分子量分布，根据G P C曲线计算重均分子量 （M W） 大于40000的百分比为59.7%、60.0%、60.4%、60.1%、60.6%、59.2%、59.4%，R S D为0.85%，表明供试品溶液在24小时内稳定，仪器的稳定性良好。

2.8 样品测定

取3批云芝糖肽，按“2.4”项下制备供试品溶液3份，然后按“2.1”项下色谱条件测定，样品分离色谱图见图2、分子量分布图见图3、根据G P C曲线计算分子量大于40000百分含量见表1。

图2 样品分离色谱图

图3 分子量分布图

表1 样品测定结果

3 讨论

（1）本文采用凝胶色谱法测定云芝糖肽分子量分布，并对此方法进行了系统适应性、精密度、重复性和稳定性考察，证明该法具有操作简便，灵敏度高，重现性好的特点，可用于生产质量控制。

（2）本实验曾对中TSK-GELG 4000P W和G 5000P W两柱串联使用[2]进行了比较，结果表明：串联使用虽然增大了分子排阻范围，但分辨率并不高。TSK-GELG 4000S W色谱柱更适合分离这种含有结合蛋白的多糖大分子。

（3）由于流动相盐浓度相对较低，易生长细菌，故建议色谱柱及时清洗并在适当条件下保存以延长色谱柱使用寿命。

1]N gT B．A review ofresearch on theprotein-bound polysaccharide （polysaccharopeptide,PSP）from the mushroom Coriolus versicolor（basidiom ycetes:Polyporaceae）[J].G eneral Pharm acology ,1998,30（1）,l-4．

[2]张志花,杨晓彤,方积年.云芝糖肽在高效液相凝胶柱上色谱行为的研究[J].色谱,1997,15（02）:150-151.

[3]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].北京:中国医药科技出版社,2010.

Determination of the Molecular Weight Distribution of Posaverptidum（PSP）by GPC

GAO Ping
（Aland（Jiangsu）Nutraceutical Co.,Ltd.,Jingjiang Jiangsu 214500,China）

Objective To establish GPC method of analysis the molecular weight and molecular weight distribution of Posaverptidum.Methods Using HPSEC method,the TSK G4000SW column was useDAt 30℃,with 0.02mol/L sodium acetate solution were useDAs mobile phase,and with a flow rate of 0.50ml/min anDAn injection volume of 10μ L,using dextrans with known molecular weights as calibration standards，and RI detector was used.Results A method was establisheDAnd three samples were analyzed by the method.The chromatograms and Weight-average molecular weights and Relative content of weight-average molecular weight more than 40,000of polysaccharide in the samples were obtained 59.7%，63.6%，66.6%.Conclusion The method is simple，rapiDAnd convenient．It can be used in the quality control of Posaverptidum.

posaverptidum;GPC;molecular weight distribution;determination

O63文献标设码：A

1671-0142（2011）02-0061-02

高平（1976-），男，江苏靖江人，工程师.

（责任编辑施 翔）