多菌种混合发酵木瓜保健果醋工艺研究

李 燕,余正波,李 政,高 冰,陶兴无

(武汉工业学院生物与制药工程学院,湖北武汉 430023)

木瓜〔Chaenomeles sinensis(Thouin.)Koehne〕,属蔷薇科木瓜属植物,是我国特有果木之一,木瓜的营养价值很高,含有多种矿物元素和维生素[1]。木瓜还具有药用和观赏价值[2],且有“百益之果”之称。但鲜木瓜含有大量有机酸[3],带有酸、涩味,纤维较多,口感较差,通常不鲜食。木瓜作果醋可以降低醋酸的刺激感,结合木瓜本身含有的有机酸和护肝抗病毒的齐墩果酸等有效药理成分,木瓜果醋可以发挥其特殊的保健作用[4]。木瓜本身的含糖量很低,我们尝试用含糖量较高的且营养丰富的萌芽米,进行木瓜萌芽米复合果醋的酿制。萌芽米富含γ-氨基丁酸 (γ-Aminobutyric Acid,GABA),营养医学研究证明,GABA为哺乳动物中枢神经系统重要的抑制性神经递质,具有降压、抗惊厥、改善脑机能、促进长期记忆和生长激素分泌等功能[5]。

目前有关木瓜果醋的研究报道[6-8],均以醋酸菌和酵母菌为菌种,并使用糖化酶等工业酶,关于多菌种混合发酵尤其是与乳酸菌联合发酵酿制木瓜果醋的研究尚未见报道。我们在木瓜萌芽米复合果醋的酿造过程中,加入乳酸菌增加果醋中乳酸的含量,可促进加速发酵过程的进行;接入红曲霉和黑曲霉,利用红曲霉和黑曲霉生长过程中产生的淀粉酶、糖化酶等活性酶进行糖化处理,增加还原糖含量的同时,也带进抑制胆固醇合成的莫纳克林 K(Monacolin K)等功能性营养物质[9];从而研制出风味独特、营养保健的木瓜醋,对开发木瓜保健调味品具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 原料、菌种、试剂、培养基和实验仪器

原料：市售木瓜,无腐烂,成熟适中;萌芽米;大片麸皮 (湖北荆门)。

菌种：红曲霉 M1(MKA2.8%),M2(MKA2.2%);黑曲霉 (沪酿 AS3.324);乳酸菌 (Prs.5、YRS7);醋酸菌 (CSJ);酵母菌 (安琪酿酒高活性增香干酵母)、酵母 1807;除黑曲霉与酵母菌外,菌种均为武汉工业学院生物实验室分离保藏的食用菌种。

1.1.1 试剂与培养基

试剂：碳酸钠,食用级;菲林试剂,自配;1%次甲基蓝溶液,自配;0.2%标准葡萄糖液,自配;0.1mol/LNaoH标准溶液,自配;0.1%酚酞试剂,自配;冰醋酸,分析纯;氯化钙,分析纯;实验用水为超纯水。

培养基：醋酸菌筛选培养基：葡萄糖 1%,酵母膏 1%,2%CaCO3,2%琼脂,灭菌后 70℃时按培养基的 4%加入无水乙醇;

醋酸菌保藏培养基：葡萄糖 1%,酵母膏 1%,2%CaCO3,2%琼脂,灭菌后 70℃时每 100mL培养基滴加 3—4滴无水乙醇;

醋酸菌活化培养基：葡萄糖 1%,酵母膏 1%,灭菌后 70℃时每 100mL培养基加入 4%的无水乙醇 5mL。

乳酸菌培养基：乳糖 2%,碳酸钙 1%,氯化钠0.5%,蛋白胨 5%,牛肉膏 0.3%,酵母膏 3%,琼脂2%—2.5%,调 pH至 6.8;

1.1.2 实验仪器与设备

超净工作台、电热恒温培养箱、恒温摇床、电热手提式蒸气灭菌锅、生化恒温培养箱、HH—S2S恒温水浴锅、JJ—1型定时电动搅拌器、pHS—3C精密pH计、LD5-2A定时离心机等。

1.2 方法

1.2.1 麸曲的制备及菌种的活化

麸曲的制备：黑曲霉麸曲：95 g麸皮,5 g棉粕,80%水 2mL冰醋酸,混合装瓶灭菌,无菌操作接入黑曲沪酿 AS3.324,培养 7d;红曲霉麸曲：100g萌芽米,80%水,2ml冰醋酸,混合装瓶灭菌,无菌操作接入红曲 M1、M2,培养 7d;

乳酸菌的培养：无菌操作将乳酸菌接入MRS液体培养基,35℃恒温培养 2d。

酵母菌的活化：用 3%的稀糖水加 1%的安琪酿酒活性干酵母,30℃左右开放条件下不断搅拌 30—60min,直到糖水中出现大量微小气饱为止。

醋酸菌的培养与活化[10]：本实验采用的是从醋醅中分离的优良菌种。保藏菌种先经斜面活化(32—34℃,16—24 h)后,转入醋酸菌活化培养基50mL/250mL三角烧瓶中,4层纱布封口,恒温摇床(200 r/min,32℃)培养 24 h(总酸度 ≥1%)。

1.2.2 工艺流程

工艺流程见图1。

图1 果醋加工工艺流程图

1.2.3 工艺要点

木瓜汁：选择成熟未腐烂变质的木瓜,用清水冲洗数次,切开去籽去瓤,以免产生厚重的苦味,切成2 cm见方的小方块,用榨汁机榨汁,测酸度和还原糖含量。

萌芽米糖化醪的制备：取萌芽米,粉碎 (90%以上不低于 40目),按 1∶6的比例兑水与木瓜混合,加热煮成糊状 (14-16°Be),加入氯化钙 (相当于总质量的 1‰),用调节 pH至 7.5—8.0,92℃—100℃液化 2 h,液化后冰醋酸调节 pH至 4.5—5.0,加入红曲麸曲、黑曲麸曲,水浴 60—65℃菌酶水解 (糖化)6—8 h。待糖的还原值升到最高终止,进入下一工序。

酒精发酵：以上糖化醪液,降温至 38℃以下加入 1‰的高温活性干酵母,生香干酵母和乳酸菌 (总醪液量的 2%)。干酵母在使用前应扩大活化 2h接入,前期酵母增殖期需要 35℃左右开放培养 6—8 h,待醪液表面产生大量气泡并且持久不消失时,将其密封转为主发酵期 (35—38℃)。待酒精度不再上升为止,即为酒化醪,巴氏消毒后,进入下步工序;总发酵时间为 72 h左右。

醋酸发酵：按酒化醪与醋酸菌的体积比 10∶1接入经活化的醋酸菌于成熟的酒化醪中,置恒温摇床上进行醋酸发酵,调节转速为 150 r/min,32℃培养3d后,调节转速为 300 r/min,以促进醋酸菌发酵产酸。后期为了防止醋酸过度氧化生成二氧化碳和水,置恒温养箱培养。每 8 h测定一次酸度的变化,当酸味纯正、连续几次测定酸含量不再增加或增加缓慢时即可结束醋酸发酵。经过滤、澄清,灭菌后即得成品醋。

1.3 分析项目及方法[11]

食醋中总酸的测定：酸碱中和法;

酒精度测定：蒸馏法测定;

总糖和还原糖 (以葡萄糖计)的测定：DNS试剂法。

微生物的检测：按 (GB2746-85)食品卫生微生物检测方法测定;

感官评定：从色泽,形态,口感香气四个方面评价,采用 100分制。

1.4 发酵工艺参数优化

由于不同的原料配比及菌种,在相同的条件下制得的复合果醋在色泽,风味,和口感上会有明显的差异[12],因此本实验控制温度、酸度等外界条件,研究不同配方及不同的菌种接入酿造果醋,根据检测结果筛选出最佳方案。

将萌芽米,木瓜,红曲霉麸曲、黑曲霉麸曲,按不同比例配比进行实验,并在对照组中加入乳酸菌,对比其发酵结果。具体方案见表1。

表1 实验方案设计

续表

按上述实验方案进行预实验,其中方案 2,3,5,8效果较好,选择这四组方案进行工艺优化实验,从而确定最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 液态发酵中还原糖的变化

木瓜萌芽米复合果醋的酿造过程中,主要利用红曲霉、黑曲霉生长过程中产生的淀粉酶、糖化酶、纤维素酶等活性酶进行糖化,增加还原糖含量的同时,也带进莫纳克林 K等功能性营养物质。糖化过程中还原糖的变化见图2。

图2 糖化与酒精发酵阶段还原糖的变化

根据趋势线可以观察到原料在经过 2h的液化阶段后还原值均维持在 2.0 g/100mL左右,进入糖化阶段,还原值均迅速上升。在反应进行到 10 h左右时达到最高峰。当原料处在酒精发酵的前阶段中,前 8 h由于酵母处在增殖期,因此还原糖值下降缓慢,当进行到 18 h左右时,酒精发酵进入主发酵期,还原糖被大量消耗,其还原值也大幅度的下降,直到维持在 0.1 g/100mL左右。其中在糖化阶段,方案 5还原糖值在糖化阶段上升的最高为 6.21 g/100mL,其次是方案 2为 5.85g/100mL,方案 8还原糖值最低 5.54g/100mL。在酒精发酵阶段方案 8下降的最快。

2.2 液态发酵中酒精度的变化

酒精发酵在整个液态发酵过程中很重要,酒精发酵的能力直接影响到下一步醋酸发酵的效果。根据趋势图 (图2),可以观察到糖化阶段后期就有酒精的产生,这不是酵母产生的,而是红曲进行酒精发酵的结果,以前的试验中也证实红曲有酒精发酵能力。在酒精发酵阶段初期,酒精度缓慢上升,8 h后进入主发酵阶段,酒精度迅速上升,70h左右时达到最高。

酒精发酵阶段中方案 5的酒精度最高为 6.9%(V/V),但是发酵所需要的时间最长。其次是方案 8为 6.1%(V/V),但是其发酵的时间最短。方案 2和方案 3发酵中的酒精度要比方案 5和方案 8低。可见,加入乳酸菌可促进加速发酵过程的进行。

图3 酒精度在发酵过程中的变化

2.3 液态发酵中酸度的变化

酸度在酒清发酵阶段维持在 0.7 g/100mL左右,是正常酒精发酵特征。在醋酸发酵阶段,前期数据呈波浪形上升趋势,整个过程持续了 6 d,达到最高酸度。其中,1—4 d酸度上升较快,而 4—6 d酸度上升平稳。在趋势图中可以发现方案 8的酸度最高为 3.62g/100mL,在发酵到 150 h后上升缓慢,最终维持在 3.61左右。其次为方案 5,最高酸度为3.57g/100mL。在发酵到 160 h后上升缓慢 ,最终维持在3.55g/100ml左右。方案2和方案3的最高酸度要明显低于方案 5和方案 8。

图4 发酵过程中酸度的变化

2.4 萌芽米木瓜复合果醋的质量检测

2.4.1 感官指标

色泽：淡黄色,透明,光泽度好;香气：具有木瓜特有的香味;口味：酸甜可口,无其它异味;体态：澄清透明,无悬浮物。感官评分见表2和表3。

表2 评分细则表和表3

表3 感官评测表

感官指标排名：5＞8＞2＞3,从排名中可以发现5与 8组 (加乳酸菌)要比 2与 3组对照组在相同外界条件下的产醋质量和品质高。

2.4.2 理化指标

总酸 (以酸度计)：≥3.62 g/100mL;可溶固形物 ：≥5 g/100mL;砷 (以 As计 )：≤0.5mg/kg;铅 (以Pb计)：≤1.0mg/kg,桔霉素未检出。

2.4.3 微生物指标

细菌个数：≤100个 /mL;大肠杆菌群：≤3/100 mL,致病菌未检出。

3 结论

最佳木瓜萌芽米复合果醋酿造工艺：(1)木瓜萌芽米质量比 3∶5,液化温度 92℃,糖化过程温度60℃,红曲接种量为 2%,黑曲接种量为 1%,(2)酒精发酵温度 32℃,干酵母用量为 1‰,乳酸菌接入量2%,(3)醋酸发酵的温度 35℃,醋酸菌接种量 5%。糖化阶段还原糖值可以达到 6.21 g/100mL,酒精发酵阶段酒精度可以达到 6.9%(V/V),醋酸发酵阶段酸度可以达到 3.62 g/100mL,生产的果醋具有浓郁的果醋味,酸甜适度,色泽透明。

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[7] 周帼萍,汪芳安,张佑平.木瓜复合果醋的酿制 [J].食品科学、2005(10)：274-276.

[8] 王蕊,高 翔.木瓜保健果醋的工艺研究[J].中国酿造、2004(8)：35-37.

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