不同纯化兔抗苏丹红ⅠIgG方法的比较

张大川，付云洁，刘志国，梁莉甜，李 琦

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

免疫球蛋白作为一类重要的免疫效应分子，是由高等动物免疫系统产生的蛋白质，通过抗原诱导可转化为抗体。其中，IgG是存在于血液、淋巴、腹腔液中的主要免疫球蛋白，但它的存在介质中含有非常复杂的混合物，为了消除杂蛋白干扰，获得纯度较高的IgG，本实验采用辛酸硫酸铵及亲和层析两种方法对血清进行纯化，并从纯度、蛋白质含量、抗体效价等方面比较两种方法的纯化效果，为今后的抗体纯化提供一种高效实用的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试剂：辛酸、硫酸胺、环氧氯丙烷，分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司;Sepharose 4B，北京鼎国生物技术有限公司;戊二醛，分析纯，国药集团生物技术有限公司。

仪器：奥地利SUNRISE酶标仪;天美8500紫外扫描仪;北京六一DYY-5型电泳仪;Kodak 1D凝胶成像系统;科力生化培养箱。

1.2 方法

1.2.1 苏丹红I多克隆抗体的制备

按照常规程序［1］免疫新西兰白兔，免疫中期对兔进行耳缘静脉取血，双向琼脂扩散试验检测抗体效价，效价合格后通过颈动脉采血的方法获得抗血清。

1.2.2 苏丹红I多克隆抗体的纯化

收集的抗血清分别通过辛酸硫酸铵法和亲和层析柱法进行纯化。辛酸硫酸铵法参照文献［2，3］进行。

亲和层析柱的制备方法如下［4，5］：取5 g经环氧氯丙烷偶联活化的琼脂糖［6］，加入10mL氨水以使环氧基团氨解，室温反应过夜。将水解后的琼脂糖载体用蒸馏水大量冲洗并抽滤，加入30 mL 5%的戊二醛溶液，室温反应2 h，用大量蒸馏水冲洗并抽滤，得到带有活性醛基的琼脂糖凝胶。

将1.0 mL 0.5 mol/L 的磷酸钠溶液(pH 7.5)和1.0 mL苏丹红 I-BSA抗原(10 mg/mL)加入0.5 g活化的琼脂糖凝胶中，用摇床在室温下震荡混匀2 h或4℃过夜，0.5 mol/L磷酸钠溶液(pH 7.5)洗涤微球。然后加入10倍体积的1 mol/L乙醇胺(pH 7.5)，室温下孵育4 h，以屏蔽未反应的环氧基团。加入1%BSA室温反应2 h以封闭未反应的醛基，用 PBS 洗净备用［7］。

将抗血清用0.02 mol/L PBS以1∶10稀释，缓慢过柱，用0.02 mol/L PBS洗涤以除去未结合的杂蛋白，再用3 mol/L硫氰酸钾洗脱，收集特异性IgG抗体。硫氰酸钾对抗体有破环作用，因此抗体收集完应及时透析。

1.2.3 纯化苏丹红Ⅰ多克隆抗体的测定

将上述两种方法分别利用琼脂双向扩散试验法检测抗体的效价，BCA法测定蛋白质含量、SDSPAGE测定抗体的纯度，比较兔抗IgG的纯化结果。

2 结果与讨论

2.1 抗苏丹红Ⅰ血清效价的测定

新西兰兔免疫三周后，用琼脂双扩实验检测抗体效价在1∶32，再加强免疫两次，最后一次免疫完成，5 d后采用颈动脉采血法收集血清。

经辛酸硫酸铵纯化后的抗血清效价为1∶64，亲和层析法纯化后的抗体效价为1∶128，因此，亲和层析法的纯化效果较为理想。

2.2 IgG纯度的测定

将纯化前的血清、亲和层析法纯化后的血清和辛酸硫酸铵纯化后的血清进行SDS-PAGE纯度测定(图1)。

图1 SDS-PAGE电泳结果

结果表明，纯化前的血清有多条带，即含有较多的蛋白。经辛酸硫酸铵纯化后，有3—4条较明显的条带，血清经纯化后，大部分杂蛋白被除去;经亲和层析纯化后，条带较为明显，有两条带，一条为重链，分子量约55 KD，另一条为轻链，分子量约14 KD，与IgG抗体的重链和轻链的分子量比较符合，说明获得的抗体较纯。

2.3 IgG浓度的测定

BCA法分别测定纯化前的血清、辛酸硫酸铵纯化后的抗体以及亲和层析柱纯化后的抗体的蛋白含量。

BCA法测定的标准曲线(图2)为：y=0.3851x+0.1967，由此得到的上述样品蛋白质浓度依次为：7.86 mg/mL，5.53 mg/mL，2.08 mg/mL。

图2 BCA法标准曲线

3 结论

本研究采用亲和层析法和辛酸硫酸铵法，分别纯化兔抗苏丹红I多克隆抗体。实验结果表明，两种方法均能够满足免疫学实验的要求，虽然辛酸硫酸铵法获得的抗体浓度明显高于亲和层析法，但SDS-PAGE电泳结果显示，亲和层析法获得的抗体纯度较高，为今后利用该特异性抗体制备胶体金免疫层析试纸、ELISA等免疫诊断实验奠定了良好的基础。

［1］ 陶义训.免疫学和免疫学检测［M］.北京：人民卫生出版社，2001：107-108.

［2］ 马贵军，韩素娟，剡根强，等.应用辛酸硫酸铵法提取纯化兔IgG［J］.上海畜牧兽医通讯.2007(4)：33.

［3］ 武薇，韩克光.两种方法纯化兔抗绵羊肺炎支原体IgG的比较［J］.中国动物检疫.2010(27)：31-32.

［4］ E.哈洛，D.莱恩.抗体技术实验指南 ［M］.沈关心，龚非力.北京：科学出版社，2002：52-54.

［5］ 王廷华，李官成，Xin-Fu Zhou.抗体理论与技术［M］.北京：科学出版社，2005：88-89.

［6］ 褚佳强，张卫华，余耀庭，等.IgA肾病免疫吸附剂的研究(Ⅲ)［J］.高等学校化学学报，2004(15)：1454-1457.

［7］ 邢克礼，褚佳强，余耀庭.IgA肾病免疫吸附剂吸附性能及血液相容性研究［J］.离子交换与吸附，2003，19(3)：241-246.