发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的化学修饰

沈汪洋，金征宇

(1.武汉工业学院 食品科学与工程学院，湖北武汉 430023;2.江南大学食品科学与工程学院，江苏无锡 214122)

α-半乳糖苷酶(α-Galactosidase，α-Gal;EC 3.2.1.22)是一种外切糖苷酶，可以分解蜜二糖，又称为蜜二糖酶。此酶主要水解以具有α-半乳糖苷结构的碳水化合物，因此又将蜜二糖酶命名为α-半乳糖苷酶［1］。α-半乳糖苷酶广泛存在于动物、植物及微生物中［2］。咖啡豆α-半乳糖苷酶是从咖啡豆中提取得到的一种α-半乳糖苷酶。由于此酶具有三项显著功能而受到研究者的重视：制备环糊精衍生物［3］，法布里病的临床治疗［4］，血型转换研究(B 型血转换成O型血)研究［5］。但是利用传统的方法，从咖啡豆中获得α-Gal不能满足目前的研究需求，酶活较低，成为此酶进一步应用的瓶颈。2005年，Marraccini等［6］报道在发芽咖啡豆中发现 α-Gal的酶活普遍高于咖啡豆(绿咖啡豆)来源的α-Gal酶活。本实验追踪国外报道，在从发芽咖啡豆中提取、分离、纯化得到α-Gal的基础上，深入研究α-Gal的化学修饰，找出该酶的活性中心所需的氨基酸种类和数目，为此酶的进一步应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试剂

发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶实验室自制［7］;对硝基苯酚-α-半乳糖苷，碳二亚胺，丁二酮，Sigma公司;焦碳酸二乙酯，对氯汞苯甲酸，二硫苏糖醇，二硫硝基苯甲酸，Amresco公司;N-溴代琥珀酰亚胺，三硝基苯酚，国药集团;其余试剂均为常规分析纯。

1.2 仪器与设备

HT多功能酶标仪：美国Bio-Tek公司;Direct-Q3超纯水系统：美国 Millipore公司;Delta320 pH计：梅特勒-托利多仪器有限公司;HH-2型恒温水浴锅：金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-Gal酶活和蛋白测定

酶活测定参照Marraccini的方法［6］。蛋白质含量采用Bradford法［8］测定。

1.3.2 α-Gal的化学修饰

选用几种蛋白质侧链修饰剂对发芽咖啡豆α-Gal进行化学修饰，将蛋白质侧链修饰剂分别与0.05mL α-Gal(0.1mg/mL)酶液等量混合，达到各自所需的修饰浓度，在26℃下保温30min，然后测定发芽咖啡豆α-Gal的残余酶活。以各修饰剂的缓冲液代替修饰剂，在同样条件下测定发芽咖啡豆α-Gal的酶活，以此酶活作为各自对应修饰的发芽咖啡豆α-Gal酶活的100%［9-11］。

1.3.3 色氨酸残基数的测定

用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)修饰发芽咖啡豆α-Gal，氧化的色氨酸残基数按Spande等人［12］的方法测定。将发芽咖啡豆α-Gal用pH4.0的0.1mol/L醋酸缓冲液稀释，定量加入NBS溶液，使其浓度达到实验要求，在25℃下保温30 min，测定280 nm处的光吸收值的下降值(ΔA280nm)，当ΔA280nm不再变动时，表明修饰已完成，即可定量计算被修饰的色氨酸残基数(以不加NBS的发芽咖啡豆α-Gal酶液作为对照)。计算方法如下：

式中，n为每摩尔酶中被NBS氧化的色氨酸残基摩尔数，ΔA280nm为对照酶液在280 nm处的吸光度与NBS氧化后的酶液在相同波长下的吸光度差值，W为酶的重量，1.31为Witkop因数，5500为色氨酸在280nm处的摩尔消光系数，Mr为酶的分子量，V为酶溶液的体积。

2 结果与讨论

2.1 修饰剂的反应条件

在设计化学修饰反应时，仔细选择反应条件是很关键的一步。结合一些参考文献的报道，选择几种化学修饰剂修饰发芽咖啡豆α-Gal。表1列出了各种化学剂及其修饰反应的条件。

表1 化学修饰反应的条件

2.2 α-Gal的化学修饰结果

七种化学修饰剂对发芽咖啡豆α-Gal的化学修饰结果如表2所示。

表2 α-Gal的化学修饰

当NBS的浓度为0.1 mmol/L时，α-Gal完全失活，说明色氨酸(Trp)是α-Gal活性中心的必需氨基酸。PCMB浓度为0.5 mmol/L时，α-Gal的活力只剩余15.2%。EDC浓度为1mmol/L时，α-Gal的活力只剩余41.5%。浓度为1mmol/L时，α-Gal的剩余酶活为57.8%。说明巯基(-SH)、羧基(-COOH)和组氨酸(His)可能是发芽咖啡豆α-Gal活性中心的组成部分。DIC、TNBS和DTT对α-Gal的活力影响很小，说明精氨酸(Arg)、赖氨酸(Lys)和-S-S-不是维持发α-Gal酶活的必需基团。

2.3 组氨酸残基的化学修饰

在相同的α-Gal溶液中分别加入不同量的焦碳酸二乙酯(DEPC)，测定α-Gal的残余活力，结果如图1所示。随着DEPC浓度的增大，α-Gal的活力逐渐下降，并趋向于一个稳定的值。当DEPC浓度为1.0 mmol/L 时，α-Gal残余酶活只有 57.8%，说明His可能是活性中心的组成部分，结果见图1。

图1 DEPC对α-Gal的修饰

2.4 羧基氨基酸残基的化学修饰

加入不同量的水溶性的碳二亚胺(EDC)对发芽咖啡豆α-Gal活力的影响，结果见图2所示。随着EDC浓度的增大，α-Gal活力逐渐下降，当EDC浓度达到 1.0 mmol/L时，α-Gal残余活力降至41.5%。表明发芽咖啡豆α-Gal活性中心的必需氨基酸可能含有-COOH氨基酸-谷氨酸(Glu)或天门冬氨酸(Asp)。

图2 EDC对α-Gal的修饰

2.5 巯基的化学修饰

将不同量的对氯汞苯甲酸(PCMB)加入到发芽咖啡豆 α-Gal溶液中，使其浓度分别为 0.1，0.2，0.3，0.4 和 0.5mmol/L，在26℃下保温 30min，然后测定残余酶活，结果见图3。从图中看出，随着PCMB浓度的增加，α-Gal活力逐渐下降。当PCMB浓度为0.1 mmol/L时，α-Gal残余活力快速降至35.1%，说明-SH的修饰对α-Gal的酶活是十分敏感的。当PCMB浓度增加，达到0.5 mmol/L时，α-Gal残余活力已经降至15.2%。表明-SH是维持α-Gal活性必须的基团。

图3 PCMB对α-Gal的修饰

2.6 色氨酸残基的化学修饰

在酸性条件下，NBS能够选择性地修饰蛋白质中的 Trp 残基［13-14］。

(1)色氨酸残基总数的测定

向酶液中加入8mol/L的尿素，加热煮沸5min，置于透析袋中透析，除去尿素。测定酶活，发现检测不出酶活，说明α-Gal已经完全变性。再用不同量的NBS(4mmol/L)修饰，测其280 nm处的吸光值，结果如图4所示。根据A280nm的下降数值计算被氧化修饰的 Trp残基数［15］。

图4 NBS对吸光度的影响

当加入80 μLNBS时，A280达到最低值，继续加入，A280有所回升，说明Trp残基已全部被修饰。计算A280达到最低值时和未添加NBS时的α-Gal酶液的吸光值的差值，得到ΔA280nm。带入公式计算，发现NBS共修饰了15个Trp残基。由于尿素使α-Gal变性后分子内部氨基酸完全暴露，可全部被修饰，所以发芽咖啡豆α-Gal分子中共有15个色氨酸残基。

(2)色氨酸残基的修饰与酶活力的定量关系

采用邹氏作图法研究酶的修饰与酶活力的定量关系，该方法已成为化学修饰定量处理的主要方法［16］。用不同量的NBS修饰发芽咖啡豆α-Gal，同时测定其酶活，以不加NBS的酶液酶活为100%。

其测定结果按照下式进行数据处理：

图5 α-Gal残余活力分数与被修饰色氨酸残基残余分数的关系

式中：a是活力剩余分数;x是Trp残基的剩余分数;n是Trp残基的总数;s是反应最快的非必需基团数;p是反应较快的基团数，其中包括i个必需基团。

利用邹氏作图法处理数据［10］，结果如图5所示。当i取值为1时，以a1/i对x作图基本符合直线关系，得到较好的拟合。当i取值为2时，以a1/i对x作图不符合直线关系。根据邹氏作图法的原理，取符合直线拟合的数据来反映酶残余活力分数与被修饰Trp残基残余分数的关系。

当i=1时，将符合直线关系的数据作图，以α-Gal残余活力分数a为纵坐标，以被修饰色氨酸残基残余分数x为横坐标。得到的直线如图6所示。

图6 α-Gal残余活力分数与被修饰色氨酸残基残余分数的关系

从直线关系得到：n/p=7.4118;(n-p-s)/p=4.9224。α-Gal中 Trp残基总数为 15，经计算，p值约为2;s值约为3。这说明在发芽咖啡豆α-Gal的15个色氨酸残基中，有3个反应最快的酶活性非必需基团;2个反应较快的基团，其中1个为酶活性必需基团;还有10个反应最慢或根本不反应的基团。

3 结束语

在一定浓度条件下，化学修饰剂对发芽咖啡豆α-Gal的化学修饰结果显示：色氨酸是α-Gal活性中心的必需氨基酸，-SH、-COOH和组氨酸对α-Gal的活性有影响，精氨酸、赖氨酸和-S-S-不是α-Gal的必需基团。

邹氏作图法显示发芽咖啡豆α-Gal中色氨酸残基总数为15，其中有3个反应最快的酶活性非必需基团;2个反应较快的基团，其中1个为酶活性必需基团;还有10个反应最慢或根本不反应的基团。

［1］ 杨冠东，刘芳，李荷.α-半乳糖苷酶的研究进展概况［J］.现代食品科技，2006，22(3)：275-276，279.

［2］ Dey P M，Pridham J B.Biochemistry of α-galactosidase ［J］.Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology，1972，36：91-130.

［3］ Koizumi K，Tanimoto T，Fujita K，et al.Preparation，isolation，and characterization of novel heterogeneous branched cyclomalto-oligosaccharides having β--galactosyl residue(s)on the side chain［J］.Carbohydrate Research，1993，238：75-91.

［4］ Peters F，Vermeulen A，Kho T.Anderson-Fabry＇s disease：α-galactosidase deficiency J］.Lancet，2001，357：138-140.

［5］ Lenny L L，Goldstein J.The production of group O cells［J］.Biotechnology，1991，19：75-100.

［6］ Marraccini P，Rogers W J.Biochemical and molecular characterization of from coffee beans［J］.Plant Physiology and Biochemistry，2005，43：909-920.

［7］ Shen W，Jin Z，Xu X，et al.New source of α-D-galactosidase：germinating coffee beans ［J］.Food Chemistry，2008，110：962-966.

［8］ Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding［J］.Analytical Biochemistry，1976，72：248-254

［9］ Miles E W.Modification of histidyl residues in proteins by diethylpyrocarbonate［J］.Methods in Enzymology，1977，47：431-442.

［10］ 钱世钧，郝凤兮，孟广震.大肠杆菌AS1.375 L-天门冬酰胺酶的选择性化学修饰［J］.微生物学学报，1984，24：352-356.

［11］ 夏初临，陈惠黎.人胎盘谷胱甘肽S-转移酶动力学及抑制剂的研究［J］.生物化学杂志，1989，5(4)：294-300.

［12］ Spande T F，Witkop B E.Methods in Enzymology［M］.New York：Academic Press，1967

［13］ 王红梅，刘嘉莉，杨萍，等.聚半乳糖醛酸酶中色氨酸残基的化学修饰［J］.高等学校化学学报，1995，16：211-215.

［14］ 阎伯旭，曲音波，高培基.色氨酸残基在内切葡聚糖酶分子中的作用［J］.中国生物化学与分子生物学报，1998，14：181-185.

［15］ 刘仙，高国粉，杨丽，等.菊粉酶中色氨酸残基的化学修饰及其荧光光谱［J］.高等学校化学学报，2007，28：23-25.

［16］ 袁勤生.现代酶学［M］.上海：华东理工大学出版社，2001.