正交试验法优选肝毒清胶囊的提取工艺

江春紫，陈 平，贾 放，王如锋

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

正交试验法优选肝毒清胶囊的提取工艺

江春紫，陈 平，贾 放，王如锋

(武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023)

探讨肝毒清胶囊处方中有效成分芍药苷、甘草酸、甘草苷的最佳提取工艺条件。采用正交试验，考察粉碎粒度，浸泡时间，加水量，煎煮时间，煎煮次数等因素对肝毒清胶囊处方中芍药苷、甘草酸、甘草苷提取率的影响，实验采用高效液相色谱法测定有效成分的含量。优化后的提取工艺为：甘草粒径为0.9—2mm，白芍为0.9—2mm，加16倍量的水，浸泡1 h，煎煮3次，每次2h。在此提取条件下，提取量达16.893 mg/g，优选出的工艺可适用于工业化生产。

肝毒清胶囊;正交实验;提取工艺

健肝乐颗粒是目前已在临床应用多年且已上市销售的名优中成药，肝毒清胶囊是在健肝乐颗粒基础上进行二次开发研究的产品。健肝乐的原方来源于我国汉代医圣张仲景的《伤寒论》中的“芍药甘草汤”，主要功效为敛阴养血、柔肝舒筋、缓急止痛，在临床广泛应用于治疗各种内科疾患，距今已有2000多年的使用历史［1］。健肝乐颗粒就是在“芍药甘草汤”的基础上研制而成的治疗肝炎的中成药，其主要成分为从国内外公认的治疗肝炎的良药——白芍、甘草中提取到的有效部位。白芍为毛莨科植物芍药的干燥根，在处方中起君药作用，其主要有效成分为芍药总苷，而芍药苷是芍药总苷中的主要成分［2-4］;甘草系豆科甘草属植物，其有效成分有甘草酸，甘草苷［5］。因此，本文拟以芍药苷，甘草酸，甘草苷三者的总提取量的综合得量作为考察指标，对肝毒清软胶囊最佳提取工艺进行探索，为其开发提供一定的科学依据。

1 实验材料与仪器

白芍(武汉金匙药业有限公司，Radix Paeoniae Alba);甘草(湖北省中药材有限公司饮片厂，Radix Glycyrrhizae);芍药苷标准品;甘草酸、甘草苷标准品(中国药品生物制品检定所)。甲醇(色谱纯，科密欧化学试剂开发中心)，乙腈(色谱纯，科密欧化学试剂开发中心)，冰醋酸(分析纯，科密欧化学试剂开发中心)，醋酸铵(分析纯，科密欧化学试剂开发中心)，磷酸(分析纯，科密欧化学试剂开发中心)。高效液相色谱仪(鼎泰科技发展有限公司);高效液相色谱柱(Welchrom-C18;5μm，4.6 ×250 mm);高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司);电炉(武汉嘉华炉业有限公司);循环式多用真空泵(北京医疗设备厂);恒温水浴锅(北京医疗设备厂)。

2 实验方法

2.1 正交实验设计

以提取物中芍药苷、甘草酸、甘草苷三者的含量为指标，实验考察了白芍粒度(A)，甘草粒度(B)，浸泡时间(C)，加水量(D)，煎煮时间(E)，煎煮次数(F)六个因素对提取结果的影响，每个因素按3个水平设计实验方案(见表1)。

表1 因素水平表

2.2 供试品溶液的制备

按照正交表L27(313)称取白芍∶甘草=1.5∶1总共5g，加水、浸泡、煎煮、滤过，滤液定容于150mL容量瓶中，取出25mL定容于100mL容量瓶中，用0.45μm的微孔滤膜过滤，取25μL注入液相色谱仪测定。

2.3 芍药苷、甘草酸和甘草苷的含量测定方法［6］

①色谱柱为Welchrom C18(5μm，4.6 ×250 mm)，柱温30℃，流量1.0mL/min，芍药苷流动相为乙腈—0.1%磷酸(16∶84)，检测波长为230nm;甘草酸流动相为甲醇—0.2mol/L醋酸铵溶液—冰醋酸(67∶33∶1)，检测波长为250nm;甘草苷流动相为乙腈—0.5%冰醋酸(20∶80)，检测波长为276nm。

②测定方法：精密吸取标准品和供试品溶液25 μL，注入液相色谱仪，测定即可。

③芍药苷、甘草酸、甘草苷标准品和样品的高效液相(HPLC)图谱见图1。

2.3.1 芍药苷的标准曲线的绘制

精密称取芍药苷标准品3.4 mg，加甲醇溶解于25 mL的容量瓶中，用微量移液器取出20 μL、40μL、 80 μL 、 120 μL 、 160 μL，配成浓度为0.0136mg/mL、0.0272mg/mL 、0.0544mg/mL 、0.0816mg/mL、0.1088mg/mL 的标准溶液，进样，记录积分面积。以峰面积对芍药苷浓度进行拟合，得标准曲线方程：A=457.84x －1.3959，r=0.9992。

2.3.2 甘草酸的标准曲线的绘制

精密吸取甘草酸标准品5.3 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，既得(0.212mg/mL)。精密吸取甘草酸标准品溶液0.5 mL、1mL、2mL、4mL、8mL置10mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制成浓度为10.6 μg/mL、21.2μg/mL、 42.4 μg/mL 、 84.8 μg/mL 、 169.6 μg/mL的标准品溶液，摇匀，取25μL依次注入液相色谱仪测定。以甘草酸浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得回归方程为 A=0.21x－0.0711，r=0.9998。

2.3.3 甘草苷的标准曲线的绘制

精密吸取甘草苷标准品5.3 mg，置于25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，既得(0.212mg/mL)。精密吸取上述甘草苷标准品溶液50μL ，100 μL，200 μL，400 μL，800 μL，加甲醇稀释至 1mL，制成浓度为 10.6 μg/mL，21.2 μg/mL，42.4 μg/mL，84.8μg/mL，169.6μg/mL 的标准品溶液，摇匀，取25 μL依次注入液相色谱仪测定。以甘草苷浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，得回归方程为 A=518.15x －0.4417，r=0.9993。

图1 样品的高效液相色谱图

2.4 实验方法考察

2.4.1 精密度实验

取同一浓度的芍药苷、同一浓度甘草酸、同一浓度甘草苷标准品溶液，连续进样6次，计算峰面积。结果表明，芍药苷、甘草酸、甘草苷的峰面积的相对标准偏差(RSD)分别为0.16%，2.34%，1.76%，均小于5%，表明该仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性实验

取同一批白芍、甘草药材，按照供试品溶液的制备方法制成供试溶液，进样25μL，由峰面积与浓度的线性关系换算得浓度，测得芍药苷、甘草酸、甘草苷的峰面积的 RSD 分别为2.96%，4.62%，1.38%，均小于5%，表明该实验的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取供试品溶液在室温下保存，分别于0 h，4 h，8 h，16h，24h测定含量，以标准品与供试品溶液的峰面积之比进行统计。供试品在24 h之内稳定，芍药苷、甘草酸、甘草苷峰面积的相对标准偏差RSD分别为 1.54%，0.93%，1.05%，表明芍药苷、甘草酸和甘草苷在24h内的稳定性良好。

2.4.4 回收率试验

称取6份已知含量的白芍甘草药材，每份5 g，分别精密加入10mL芍药苷甘草酸甘草苷对照品溶液(含芍药苷 1.36 mg，含甘草酸 2.12 mg，含甘草苷2.12mg)，照2.2中供试品溶液的制备方法分别制备样品，进样测定，测得总量减去各组分含量，即得回收率，算得芍药苷、甘草酸、甘草苷的回收率分别为 98.1%，103.54%，100.05%，表明三者的回收率良好。

3 正交试验结果

根据白芍甘草两味药材在处方中的比例，确定芍药苷、甘草酸、甘草苷的权重系数分别为0.6，0.2，0.2，其综合得量即为：综合得量 =(芍药苷含量×0.6)+(甘草酸含量×0.2)+(甘草苷含量×0.2)。正交试验结果及分析见表2、表3。

表2 正交试验结果

对上述实验结果进行直观分析和方差分析，结果表明，煎煮次数、甘草粒度、煎煮时间和加水量对白芍甘草的综合提取率有非常显著的影响，而白芍粒径与浸泡时间两个因素对实验结果没有显著性影响，各因素对综合提取率影响的大小顺序为煎煮次数＞甘草粒径＞煎煮时间＞加水量＞白芍粒径＞浸泡时间。由试验结果分析可知最佳提取工艺为F3B2E3D2A3C1，即甘草粒径为0.9—2mm，白芍粒径为0.9—2mm，加16倍量的水，浸泡 1 h，煎煮三次，每次2h。在此提取条件下，综合提取率最高，可达16.893mg/g。上述实验结果见表2、表3。

表3 方差分析表

4 结论

从上面的正交实验表可看出，煎煮次数和甘草粒径对实验结果影响很显著。中药的煎煮是中药中的有效成分不断释放，溶解的过程，当中药中与药液中的有效成分浓度平衡后，这个过程就停止了［7］。故我们通常增加煎煮次数以获取更多的有效成分，通常以2—3次为宜。从上面正交实验表格中数据可知，白芍甘草混合煎煮时煎3次最佳。从正交表2可看出，甘草酸粒径对芍药苷的含量也有显著的影响，有文献报道，甘草中的甘草酸有增溶作用［8］;另也有文献报道，甘草与白芍混合煎煮时，甘草能促进白芍中有效成分含量的提取［9］。故甘草酸的粒径对芍药苷含量的显著影响是有科学依据的。

由高效液相图谱可见，芍药苷、甘草酸、甘草苷的分离度较好，且出峰时间适中。

正交实验结果表明，提取次数对提取率影响最大，甘草粒径次之，浸泡时间影响最小。为考虑生产成本，本实验最终确定的提取工艺为：甘草粒径0.9—2mm，白芍粒径为 0.9—2 mm，加 16 倍量的水，浸泡1h，煎煮3次，每次2 h。在此提取条件下，综合提取率可达16.893mg/g。

［1］ 陈平，陈新.健肝乐软胶囊的质量标准控制［J］.中国医院药学杂志，2007，27(11)：1528-1530.

［2］ 陈四平，张浩.中药白芍的研究进展［J］.承德医学院学报.2008.25(3)：293-295.

［3］ 张雪荣，张静.RP-HPLC法测定健肝乐颗粒中芍药苷的含量［J］.安徽农业科学，2009，37(21)：9834-9835.

［4］ 谷满仓，钱亚芳.白芍的化学成分及质量控制方法研究进展［J］.科技通报，2006，22(3)：337-341.

［5］ 陈红.甘草药理作用概述［J］.海峡药学，2005，17(4)：37-41.

［6］ 中华人民共和国药典委员会.中国药典2005版(一部)［M］.北京：化学工业出版社，2005：76.

［7］ 廖仰平.煎煮工艺对汤剂质量的影响［J］.中国民族民间医药.2008，9(3)：9-10.

［8］ 杜薇.甘草的溶解性研究［J］.湖南中医药导报，1996，2(6).32-33.

［9］ 何丽仙，黄宗京.HPLC研究芍药甘草汤合煎与分煎的化学成分变化［J］.云南师范大学学报，2009，29(6)：32-35.

Optimization of extraction process of“GanDuQing”capsule by orthogonal design

JIANG Chun-zi，CHEN Ping，JIA Fang，WANG Ru-feng
(School of Biology and Pharmaceutical Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

To study the optimization extraction process conditions of paeoniflorin and liquorice in“GanDuQing”capsule，we study the experimental conditions such as time and ratio of material－ fluid influencing the extracting efficiency of White paeoniae alba and liquorice.The result is as follows，when the liquorice particlesize is 0.9-2mm，white Paeony Root is 0.9-2mm，ratio of material－ fluid is 1∶16 and soaking time is 1h，extraction 3 times and each time is 2h，the total extraction rate of“GanDuQing”capsule is 16.893mg/g.The optimum extraction technology is scientific and reasonable，and it is suitable for industrial production.

“Gan Du Qing”capsule;orthogonal test;extraction technology

TQ 461

A

1009-4881(2011)02-0024-05

10.3969/j.issn.1009-4881.2011.02.007

2010-11-22.

江春紫(1984-)，女，硕士研究生，E-mail：iznuhzgnaij@163.com.

陈平(1958-)，女，教授，E-mail：chenpingvip24@163.com.