同步提取棉花DNA和RNA的方法

朱新霞，艾尼江，闫洁，赵海

（1石河子大学生命科学院，石河子832000；2新疆石河子棉花所，石河子832000）

棉花（Gossypiumspp．）组织中富含多糖、脂类以及多酚、色素等次生代谢物质，这些物质在DNA和RNA提取过程中较难以去除干净，其以不同方式干扰DNA和RNA的提取。目前应用于棉花总DNA提取的方法主要有SDS法、CTAB法、PVP40法、氯仿－异戊醇法、β－巯基乙醇法、改良Trizol法以及 DNA 提取试剂盒［1－5］，应用于棉花总 RNA 提 取的方法主要有异硫氰酸胍法、冷酚法、SDS／酸酚法、高盐高pH值提取法、CTAB／酸酚法、RNA提取试剂盒［6－10］，这些方法（除试剂盒）虽能提取出棉花的DNA或RNA，但提取步骤比较繁杂，所耗试剂较多、提取周期比较长，有的甚至还需要2d。试剂盒相比而言操作简便、能快速提取棉花组织的DNA或RNA，但产率低且价格昂贵，提取成本较高，对于样品数量较少的样本和样品种类较多的实验材料局限性较大。

为节约样品数量、降低成本、简捷快速地提取棉花DNA与RNA，本实验以棉花幼苗为试材，通过对棉花基因组DNA或RNA提取方法的比较分析，针对棉花富含酚类、多糖、单宁等次生物质的特点，借鉴前人提取DNA和RNA的方法，通过改进常规试剂CTAB法提取程序和相关技术参数，摸索出一套简便、快速、低成本的高纯度棉花DNA和RNA同步提取的方法，以期为棉花分子生物学的研究奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料

试验材料为室内培养的高度约20cm的杂交棉及其亲本幼苗，分别取其顶端叶片贮存于－80℃超低温冰箱中备用。所用试剂中，焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）、β－巯 基 乙 醇 （β－mercaptoethanol）购自Amresco公司，十六烷基三甲基溴化胺（hexadecyltrimethylammonium bromide，CTAB）、聚乙烯吡咯烷酮（polywiny pyrro lidone40，PVP40）、三羟甲基氨基甲烷（TRIS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）等均购自上海生工公司，其它常规试剂均为国产分析纯。

所用试剂和塑料耗材均需预先用0．1%DEPC处理24h后高温灭菌，研钵等物品则经180℃高温烘烤2h以上，以避免RNase的污染。

1．2 方法

1）取1g左右的棉花新鲜幼嫩组织，加液氮充分研磨呈粉末状，及时转移到10mL离心管中，加5 ml的提取缓冲液（1．4mol／L NaCl，0．1mol／L Tris－HCl（pH＝8．0），20mmol／L EDTA，2%CTAB，2%PVP，1%β－巯基乙醇），振荡混匀，65℃水浴约20min，中间混合2～3次；

2）加0．6倍体积的氯仿，充分混匀，然后冰浴静置10min；4℃，8000r／min离心20min，将上清液转移到另一新10mL离心管中，加入1／3倍体积的8mol／L的LiCl溶液，颠倒混匀，－20℃静置2 h，4℃，8000r／min离心20min，将上清和沉淀分置2个离心管中；

3）在上清液离心管中，加入0．6倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，絮状DNA用玻璃棒搅出，用70%乙醇重悬洗涤2次絮状DNA后，加5mL dd H2O溶解，再加入0．6倍体积氯仿：异戊醇（24∶1），震荡混匀，4℃静置片刻，8000r／min离心15min，取上清加入0．6倍体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，于－20℃静置1h，絮状DNA用玻璃棒搅出，用70%乙醇重悬洗涤2次，5000r／min离心5min，吸去残余水滴，待干后加入适量TE＋RNase A溶液（10mmol／L Tris－HCl pH 8．0，1mmol／L EDTA pH 8．0，RNase A终浓度为100μg／mL），37℃水浴中温育溶解，取2μL检测DNA质量（1μL用于0．8%（W／V）琼脂糖凝胶电泳，1μL用于分光光度计测吸光值），剩余DNA放于－70℃冰箱保存。

4）在2）弃去上清溶液的离心管中用70%乙醇洗涤沉淀2次，真空抽干后加入50μL无RNase的dd H2O充分溶解并转入1．5mL离心管中；

5）总RNA中DNA的消化，反应体系如下：总RNA（10～100μg），RNA 酶抑制剂（20U），不含RNA酶的DNA酶I（10U），5×DNDNase 1Buffer（10μL），用无 RNase的ddH2O补至总体积500 μL，37℃温育20min，加入500μL酚／氯仿（1∶1），漩涡混匀，4℃静置片刻，12000r／min离心15min；将上清移至一干净的微量离心管中，加入等体积氯仿，振荡，4℃静置片刻，12000r／min离心15min；取上清加入3mol／L pH 5．2的乙酸钠、2倍体积的无水乙醇，－70℃放置30min～2h，12000r／min离心10min，弃上清，用500μL 70%乙醇洗涤沉淀2次，真空抽干，用35μL无RNase的ddH2O溶解沉淀，取2μL检测RNA质量（1μL用于1．2%（W／V）琼脂糖凝胶电泳，1μL用于分光光度计测吸光值），剩余RNA放于－70℃冰箱保存。

2 结果与分析

2．1 总DNA和RNA的质量检测

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明：此方法所提取的总DNA都比较完整（图1），所提的总RNA可明显看到28S、18S条带，条带整齐一致，28S亮度明显高于18S（图2），表明RNA降解很少，保持了RNA较好的完整性。

图1 棉花总DNAFig．1 The total DNA from cotton

图2 棉花总RNAFig．2 The total RNA from cotton

此方法所提总DNA经紫外分光光度计检测，发现OD260／280值均为1．7～1．85，说明此方法所提总DNA无糖类、酚及蛋白质等的污染，与琼脂糖凝胶电泳结果相符；所提总RNA经紫外分光光度计检测，OD260／280值均为1．85～1．99，表明此方法所提总RNA无DNA或蛋白质污染；OD260／OD230值均大于2．0，表明此方法可较有效地去除多糖等杂质。

2．2 总DNA的PCR检测

扩增检测。SSR研究主要参考文献［11］中的方法；AFLP研究主要参考参照文献［12－14］中的方法，并稍作调整。

结果（图3、4）表明：用该法提取的总DNA用于SSR和AFLP扩增，均可扩增出清晰的条带且稳定性好，这表明用该法提取的总DNA质量符合后续实验的要求，可作为分子标记应用在棉花分子生物学研究中。

本研究直接用所提总DNA进行SSR和AFLP

图3 SSR检测Fig．3SSR amplification results from DNA

图4 AFLP检测（HpaⅡ、MspⅠ酶切后扩增条带）Fig．4AFLP amplification results from DNA

2．3 总RNA的PCR检测

RT－PCR方法是检测RNA质量的良好方法，多糖等杂质的污染将抑制RNA的反转录［4］，扩增基因的完整编码区需要有良好的RNA完整性，即便微量的降解也会使mRNA反转录的cDNA长度大大减小，导致RT－PCR的失败。因此，为了更加准确地了解该法提取的总RNA是否能满足后续分子生物学实验的要求，本研究选择1对在棉花各组织cDNA中都可扩增出500bp产物的棉花组成型表达基因 EF1α的引物（F：5′－AGACCACCAAGTACTACTGCAC－3′，5′－CCACCAATCTTGTACACATCC－3′）对所提RNA 的反转录产物进行RTPCR检测，琼脂糖电泳检测在预期500bp处出现亮的条带（图5），同时参照文献［15－17］中的方法对所提RNA的反转录产物进行cDNA－AFLP扩增检测（图6），也得到了清晰稳定的条带，证实本研究制备的RNA的完整性好，并且纯度较高，符合后续实验工作的要求。

图5 RT－PCR检测Fig．5RT－PCR amplification results from RNA Fig

图6 cDNA－AFLP检测（2对引物扩增条带）Fig．6cDNA－AFLP amplification results from RNA

3 讨论

棉花富含多糖、酚类、单宁等次生物质，如多糖、脂类的存在会使DNA、RNA的溶解度降低，同时还可以抑制许多工具酶的活性，多酚、色素等物质在提取过程中很容易被氧化导致DNA、RNA变褐活性丧失，影响DNA、RNA用于进一步的分子操作，因此能否在提取过程中尽量去除这些干扰物质是获得高质量棉花总DNA、RNA的关键。高质量的棉花组织总DNA和RNA的成功提取又是顺利进行文库和遗传图谱构建，基因克隆、表达和调控及遗传转化分析等棉花分子生物学研究的基础技术。

CTAB是一种去污剂，它能够溶解细胞膜上的蛋白质，使细胞破裂，并与细胞内的核酸形成核酸－CTAB复合物［18］，这种复合物在沉淀的时候把蛋白、多糖、色素以及多酚类化合物与核酸彻底的分离开来，此外与提取缓冲液中的EDTA一起，共同保护DNA免受内源核酸酶的降解。提取液中的β－巯基乙醇现用现加，其作为强还原剂能防止多酚被氧化，同时提取液中含有的聚乙烯吡咯烷酮（PVP－40），可与酚类化合物形成鳌合物，阻止其成为多酚氧化酶的底物而被氧化，使之不能与核酸结合，保证核酸的质量；提取液中高浓度的NaCl有利于降低多糖的含量［4］；核酸（DNA、RNA）在细胞内部主要是与蛋白质结合成复合物的形式存在，因此分离DNA、RNA时必须使其与蛋白质解离，并除去蛋白质。除去蛋白质主要用氯仿－异成醇混合液振荡核蛋白溶液，使蛋白质变性，然后通过离心分层，DNA和RNA溶于上层水相，而变性蛋白质停留在水相及氯仿相中间而被除去；本研究在上述研究基础上利用DNA和RNA在LiCl溶液中溶解度的差异将溶于上层水相的二者分离开来。在水相中加入LiCl溶液在－20℃放置一段时间后，RNA会特异性的沉淀下来，而DNA会继续留在水相中，通过离心可使RNA分离出来。而留在上清液中的DNA会和预冷的异丙醇较快生成絮状物被分离出来。提取步骤中使用的乙酸钠和低浓度的乙醇，不仅可以帮助去除多糖，还可以去除色素类物质［19］。

在提取过程中为避免所提取的DNA中含有的少量RNA对下游分子生物学实验的影响，可在加入TE溶液溶解DNA时同时加入RNase A（终浓度为100μg／mL）以除去RNA；同样为避免所提取的RNA中含有的少量DNA对下游分子生物学实验的影响，可加入不含RNA酶的DNase I除去DNA；为减少外源RNase对RNA的降解，试剂和塑料耗材需预先用0．1%焦碳酸二乙酯（DEPC）的水溶液浸泡处理24h后高温灭菌，为避免内源RNase对RNA的降解，可以加入适量的RNase抑制剂。同时整个提取过程中还应注意避免过酸过碱或高温环境，合适的温度为0～4℃，pH 4～9，避免剧烈振荡和防止机械力对DNA的切割作用；整个操作步骤应尽量简化，缩短实验过程，减少核酸变性、降解、机械切割的机会。

与现有的棉花总DNA和RNA提取法相比，本方法所需用样品数量、试剂、操作步骤、操作时间明显减少，整个DNA和RNA提取工作可在1d内完成。同步提取的棉花DNA和RNA，能满足后续分子生物学实 验如 SSR、AFLP、RT－PCR、cDNAAFLP的要求，有效地节约了样品数量和操作时间，降低了实验成本。

4 结论

本研究在借鉴各种植物DNA和RNA提取方法的基础上，摸索出一套适合于棉花组织DNA和RNA同步提取的方法。该方法所用的都是常规试剂，不但操作简单，易于重复，同时还可节约样品数量、试剂成本及提取时间，同步提取出的高质量棉花

DNA和RNA，能满足许多后续分子生物学实验的要求，对于样品稀少珍贵的材料和样本数量较多的研究尤为适用。此研究不仅为其它下游实验的顺利进行奠定了基础，同时也可为其它多酚、多糖作物同步提取其DNA和RNA提供参考。

［1］Paterson A H，Brubaker C L，Wendel J F．A rapid method for extraction of cotton （Gossipiumspp．）genomic DNA suitable for RFLP and PCR analysis［J］．Plant Molecular Biology Report，1993，11（2）：122－127．

［2］田海燕，田新惠，李艳军，等．棉花DNA的提取及其SSR分子标记体系的建立［J］．石河子大学学报：自然科学版，2007，25（2）：150－152．

［3］宋国立，崔荣霞，王坤波，等．改良CTAB法快速提取棉花 DNA［J］．棉花学报，1998，10（5）：273－275．

［4］Fang G，Hammar S，Crumet R．A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA［J］．Biotechniques，1992，13（1）：52－56．

［5］姚宁涛，祝建波，邓福军．改良Trizol法快速提取棉叶片总 RNA［J］．生物技术通报，2010（7）：125－127．

［6］侯磊，肖月华，李先碧，等．棉花洞A雄性不育系花药发育的 mRNA差别显示［J］．遗传学报，2002，29（4）：359－363．

［7］刘长军，孟玉玲，侯蒿生，等．棉花法呢基焦磷酸合酶cDNA克隆、序列分析及其在种子发育过程中的表达特征［J］．植物学报，1998，40（8）：703－710．

［8］夏兰芹，郭三堆．棉花RNA的快速提取方法［J］．棉花学报，2000，12（4）：205－207．

［9］徐亚浓，王学德，蒋淑丽，等．排除棉酚等干扰提取棉纤维细胞RNA方法的研究［J］．棉花学报，2002，14（3）：143－146．

［10］蒋建雄，张天真．利用CTAB／酸酚法提取棉花组织总RNA［J］．棉花学报，2003，15（3）：166－167．

［11］Wang P Z，SU L，QIN L，et al．Identification and molecular apping of a Fusarium wilt resistant gene in upland cotton［J］．Theor Appl Genet，2009，119：736－739．

［12］Xu M L，Li X Q，Korban S．AFLP－based detection of DNA methylation［J］．Plant Molecular Biology Report，2000，18（4）：361－368．

［13］朱新霞，王保华，郭旺珍，等．中棉所12配制的2个杂交棉DNA甲基化遗传和传递［J］．作物学报，2009，35（12）：2150－2158．

［14］张莉，陈文霞，刘桂伶，等．新疆棉花枯萎病菌7号生理小种的AFLP分析［J］．石河子大学学报：自然科学版，2009，27（3）：298－301．

［15］Bachem C W，Oomen R J，Visser R G．Transcript imaging with cDNA－AFLP：a step－by－step protocol［J］．Plant Molecular Biology Report，1998，16（2）：157．

［16］朱新霞，朱一超，艾尼江，等．中棉所12及其选系配制的4个杂交棉幼苗期基因差异表达［J］．作物学报，2009，35（9）：1637－1645．

［17］邓晓艳，刘江娜，李志博，等．棉花耐旱相关基因的cDNAAFLP差异显示［J］．石河子大学学报：自然科学版，2010，28（5）：537－541．

［18］Brown T A．基因克隆和DNA分析［M］．5版．魏群．北京：高等教育出版社，1995．

［19］Hu C G，Honda C，Massayuki K，et al．A simple protocol for RNA isolation from fruit trees containing high levels of polysaccharides and polyphenol compounds［J］．Plant Molecular Biology Reporter，2002，20（1）：69．