eNOS基因27bpVNTR多态性与新疆汉族原发性高血压的相关性研究

邹放君，唐斌，何芳，王刚，张强，卢贤贵，钟华，石晓鹏，杨建峰，王振焕，陈雄英，邓峰美（石河子大学医学院／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子8300；石河子大学医学院第一附属医院，石河子83008）

ZOU Fangjun1，TANG Bin2，HE Fang1，WANG Gang1，ZHANG Qiang1，LU Xiangui 1，ZHONG Hua1，SHI Xiaopeng1，YANG Jianfeng1，WANG Zhenhuan1，CHEN Xiongying 1，DENG Fengmei 1

（1Medical College of Shihezi University／Key Laboratory of Ministry of Education，Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases，Shihezi 832002，China；2First Affiliated Hospital，Medical College of Shihezi University，Shihezi 832002，China）

原发性高血压（essential hypertension，EH）是遗传和环境因素共同作用的多基因遗传性疾病。内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）基因是近年来发现的EH的易感基因，由于其对血压调节的重要作用而备受重视。目前国内外已有研究发现eNOS基因第4内含子27bpVNTR 多 态 性 与 高 血压有关［1－3］，但也有不 一致的报道［4－5］。而在新疆汉族人群中尚未见报道。本研究旨在探讨eNOS基因多态性与新疆汉族人群EH的相关性。

1 对象与方法

1．1 研究对象

选取新疆天山北麓塔城地区沙湾县博尔通古乡牧区，元兴宫村、红土庄子村及乌兰乌苏镇的汉族人群，采取整群随机抽样，选择本地居住的汉族居民，均签署知情同意书，并得到石河子大学医学院一附院伦理道德委员会同意，高血压患者346例，其中男148例，女198例，平均年龄50．90±9．53岁，对照组385例，男142例，女243例，平均年龄49．75±10．27岁。病例组纳入标准均符合1999年 WHO／ISH颁布诊断标准：收缩压≥140mmHg或舒张压≥90mmHg，排除继发性高血压、心肌病、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、肝肾功能不全、孕妇、哺乳期及口服避孕药妇女。对照组纳入标准：查体健康者，收缩压＜140mmHg且舒张压＜90mmHg，无服用降压药史、高血压家族史及其他器质性心脏病史等，排除糖尿病、肝肾功能不全者。

1．2 调查内容

签署知情同意书后测量身高、体重、腰围、臀围、计算体重指数BMI＝体重（kg）／身高2（m2）和腰臀比WHR＝腰围（cm）／臀围（cm），）询问职业、文化程度、婚姻状况、吸烟、饮酒、饮食习惯、性格特点、疾病及家族史等，抽空腹血当天检测血糖、血脂（甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白）等生化指标。

1．3 荧光标记扩增产物长度多态分析检测eNOS基因多态性

1．3．1 基因组DNA提取

试验前夜禁食12h以上。次晨抽取空腹血液标本10mL，用EDTA抗凝管，分离血样。用酚－氯仿法进行DNA抽提。

1．3．2 eNOS基因目的片段扩增

设计1对荧光标记的PCR引物，用Primier primer5．0软件设计

PCR引物如下：上游：5′－tatggtagtgccttggctgga－3′，下游：5′－tgctcctgctactgacagcac－3′。

PCR反应体系：DNA模板1μL，Hotstar Taq聚合酶0．2μL，10×buffer 2μL，25mm MgCl20．4μL，dNTP 0．4μL，多重PCR引物2μL，去离子水14μL，总体系20μL。利用ABI公司的2720 Thermal Cycler预变性94℃5min后，继之进行35个循环，每个循环94℃变性30s，59℃ 退火40s，72℃ 延伸45s，最后72℃持续10min延伸。

1．3．3 eNOS基因多态性检测

取PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪成像，鉴定PCR产物。荧光PCR产物上ABI3130XL测序仪，取0．5μL纯化后的延伸产物，与0．5μL SIZE STANDARD，9μL Hi－Di混匀，95℃变性5min后上ABI3130XL测序仪。ABI3130XL测序仪上收集的原始数据用GeneMapper 4．0（AppliedBiosystems Co．，Ltd．，USA）来分析。

1．4 统计学方法

采用SPSS13．0统计学软件对数据进行统计分析，病例组与对照组计量资料比较用t检验，计量资

2 结果

2．1 研究对象一般情况

各指标如收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体重指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、肌酐、尿酸、载脂蛋白A1／B的平均水平，两组间比较均有显著差异（P＜0．05），EH 组均高于对照组；其余指标如年龄、性别、空腹血糖、甘油三脂、高密度脂蛋白、载脂蛋白－A1、载脂蛋白－B两组间均无差异（P＞0．05）。结 果见表1。

表1 新疆汉族EH组与正常对照组临床相关指标比较±STab．1Clinical parameters of essential hypertension and control subjects in the Han people in Xinjiang

表1 新疆汉族EH组与正常对照组临床相关指标比较±STab．1Clinical parameters of essential hypertension and control subjects in the Han people in Xinjiang

指标 EH（n＝346）对照组（n＝385）P年龄／岁50．90±9．53 49．75±10．27 0．218性别／（男／女） 148／198 142／243 0．104收缩压／mmHg 148．01±18．13 114．40±12．42 0．000舒张压／mmHg 94．54±9．97 78．05±7．38 0．000平均动脉压／mmHg 112．36±10．22 90．17±8．09 0．000脉压／mmHg 53．47±17．92 36．35±10．02 0．000体重指数 26．17±3．90 24．41±3．51 0．000腰臀 比 0．90±0．06 0．87±0．06 0．000空腹血糖／（mmol／L） 6．01±1．32 5．92±2．20 0．492胆固醇／（mmol／L） 4．77±1．14 4．42±0．92 0．000甘油三脂／（mmol／L） 1．68±1．51 1．43±4．23 0．283低密度脂蛋白／（mmol／L） 3．17±0．97 2．81±0．83 0．000高密度脂蛋白／（mmol／L） 1．40±0．35 1．41±0．36 0．464肌酐／（μmol／L） 66．71±16．49 62．68±17．68 0．002尿酸／（μmol／L） 271．55±86．92 245．65±110．95 0．001载脂蛋白－A1／（g／L） 1．47±0．28 1．44±0．29 0．159载脂蛋白－B／（g／L） 0．99±0．24 1．04±3．17 0．763载脂蛋白 A1／B／（g／L）1．54±0．45 1．70±0．58 0．000

2．2 新疆汉族eNOS基因27bpVNTR基因型分布的Hardy－Weinberg平衡检验

EH组和对照组及总人群的基因型分布频率均符合 Hardy－Weinberg平衡（P＞0．05），提示该人群有较好的遗传代表性（表2）。

表2 新疆汉族27bpVNTR多态性基因型分布的Hardy－Weinberg平衡检验Tab．2Hardy－Weinberg of eNOS4genotypes in the Han people in Xinjiang

2．3 新疆汉族eNOS基因27bpVNTR多态性分布及患病风险估计

27bp VNTR多态性基因型及等位基因在新疆汉族EH组与NT组间的分布见表3，4种基因型（bb、aa、ab、bc）和等位基因b、a、c在 EH 组和 NT组中分布频率之间差异均无统计学意义（P＞0．05）。见表3。

表3 新疆汉族27bp VNTR多态性基因型及等位基因分布及患病风险Tab．3Frequency distribution of eNOS4genotypes and alleles in the Han population in Xinjiang healthy and essential hypertension subjects

2．4 Logistic回归分析

以有无高血压为因变量，体重指数、腰臀比、年龄、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、eNOS各基因型等为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示体重指数增大、年龄、高血糖、高脂血症为高血压发生的独立危险因素，eNOS基因27bp VNTR多态性与高血压无关。

3 讨论

高血压是严重危害人类健康的一种常见病、多发病，发病原因未完全清楚，它的发病机制非常复杂，原发性高血压具有遗传倾向，它是一种多基因遗传性疾病，其基因表达在很大程度上受环境因素的影响。已有研究显示超重和肥胖与血压升高有关［6－8］，超重和肥胖是高血压的危险因素。本研究高血压组与对照组一般资料比较显示新疆汉族高血压人群中体质指数、腰臀比、胆固醇及低密度脂蛋白明显高于正常对照人群，提示超重、肥胖及血脂异常（包括血浆胆固醇、低密度脂蛋白浓度增高）可能为该地区汉族高血压的危险因素。进一步作Logistic回归分析校正了年龄、性别、BMI及临床指标等混杂因素后，结果显示体重指数增大、高血糖、血脂异常为该地区汉族高血压的独立危险因素，从而证实了血脂异常、超重和肥胖与该地区汉族高血压发生的有关。因此，通过改变饮食结构、生活方式，加强体力活动，控制体重，降低血脂水平，有助于预防该地区汉族高血压的发生。

本研究结果中eNOS基因27bp VNTR位点bb、aa、ab三种基因型在新疆汉族健康对照人群分布分别为79．5%、1．0%、19．2%，而非洲裔美国人分别为58．0%、14．5%、27．5%［9］，新 加 坡 人 分 别 65%、2．9%、26%［1］，内地汉族人为86．15%、0．43%、13．42%［3］，课题组研究的同一地区哈萨克族人为84．06%，0．72%，15．22%［5］，均与本研究结果汉族人群基因型频率分布存在显著性差异。另外还在在新疆汉族健康对照人群检测出重复6次串联序列的c等位基因，其分布频率为0．2%，在上述各项研究中，新加坡人群［1］中也检测出c等位基因，其分布频率为0．9%，而在非洲裔美国人［9］、内地汉族人［3］、哈萨克族人［5］群中均未检测出c等位基因。从上述各项研究中可以看出该基因多态分布特征在不同种族人群存在较大的差异。本研究结果显示，EH组和NT组基因型和等位基因分布频率无显著性差异，表明eNOS基因27bp VNTR多态性可能与新疆汉族原发性高血压不相关。Olcay等［4］对土耳其人群进行了研究，结果显示27bp VNTR多态性与EH不相关，Fengmei DENG等［5］研究了新疆哈萨克族人群，发现eNOS基因27bp VNTR多态性与EH不相关。本研究结果与上述研究结果一致，而与Moe等［1］报道相异。分析这些研究结果的差异，可能与研究对象的种族差异、地区差异、饮食环境等不同有关。这说明不同人群中基因分布特征不同会影响到与疾病的相关性。同时也提示还需进行更大样本及在不同人群中进一步研究。

［1］K T Moe，S T Lim，P Wong，et al．Association analysis of endothelial nitric oxide synthase gene polymorphism with primary hypertension in a Singapore population［J］．Journal of Human Hypertension，2006，（20）：956－963．

［2］Jemaa R，Ben Ali S，Kallel A，et al．Association of a 27－bp repeat polymorphism in intron 4of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene with hypertension in a Tunisian population［J］．Clin Biochem，2009，42（9）：852－856．

［3］赵晓云，国雪，邱长春，等．北方汉族人eNOS第四内含子a／b基因多态性与原发性高血压的关系［J］．中国康复理论与实践杂志，2005，11（6）：422－424．

［4］Olcay A，Ekmekci C G，Ozbek U，et al．Negative association of endothelial nitric oxide gene polymorphism with hypertension in Turkish patients：effect of ecNOS polymorphism on left ventricular hypertrophy［J］．Cardiovasc Ultrasound，2006，21（4）：33．

［5］Fengmei DENG，Qinghua HU，Bin TANG，et al．Endothelial Nitric Oxide Synthase Gene Intron 4，27bp Repeat Polymorphism and Essential Hypertension in the Kazakh Chinese Population［J］．Acta Biochimica et Biophysica Sinica，2007，39 （5）：311－316

［6］Wamala JF，Karyabakabo Z，Ndungutse D，et al．Prevalence factors associated with Hypertension in Rukungiri District，Uganda－A Community－Based Study［J］．African Health Sciences，2009，9（3）：153－160．

［7］Miria Suzana Burgos，Cézane Priscila Reuter，Leandro Tibiricá Burgos，et al．Comparison Analysis of Blood Pressure，Obesity，and Cardio－respiratory Fitness in Schoolchildren［J］．Arq Bras Cardiol 2010，94（6）：739－744．

［8］Li H L，Xu B，Zheng W，et al．Epidemiological characteristics of obesity and its relation to chronic diseases among middle aged and elderly men［J］．Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi，2010，31（4）：370－374．

［9］Li R，Lyn D，Lapu－Bula R，et al．Relation of endothelial nitric oxide synthase gene to plasma nit ric oxide level，endothelial function，and blood pressure in Af rican A－mericans［J］．Am J Hypertens，2004，17（7）：560－567．