条斑紫菜低覆盖度基因组草图分析

牛建峰, 高胜寒, 骆迎峰, 袁 野, 王广策, 胡松年

(1. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071; 2. 中国科学院 北京基因组研究所, 北京 100029)

条斑紫菜低覆盖度基因组草图分析

牛建峰1, 高胜寒2, 骆迎峰2, 袁 野2, 王广策1, 胡松年2

(1. 中国科学院 海洋研究所, 山东 青岛 266071; 2. 中国科学院 北京基因组研究所, 北京 100029)

对条斑紫菜(Porphyrayezoensis)进行Solexa高通量测序, 获得低覆盖度全基因组草图。该基因组草图大小约220 Mbp, GC质量分数53.08%; 包含26 629个预测基因, 其中16 409个基因具有内含子,平均每个基因含2.22个内含子; 基因结构分析表明具有内含子的基因平均长度为2 214 bp, 内含子平均大小319 bp; 代谢通路分析表明嘌呤代谢是含有蛋白数量最多的代谢途径。本研究所得条斑紫菜低覆盖度全基因组草图快速获取了基因组大小和蛋白编码基因结构等基本信息, 证明了使用Solexa高通量测序技术对条斑紫菜进行全基因组测序的可行性。

条斑紫菜(Porphyra yezoensis); Solexa高通量测序; 代谢通路

紫菜属(Porphyra)属于红藻门(Rhodophyta), 原红藻纲(Rhodophyceae), 红毛菜目(Bangiales), 红毛菜科(Bangiaceae)。全世界已发现的紫菜约130余种,广泛分布于寒带至亚热带的潮间带水域, 其中30种分布于北大西洋沿岸的欧美国家, 28种来自于日本,27种来自于太平洋沿岸的美国和加拿大, 中国特有种为坛紫菜, 除此之外, 在印度沿岸亦有报道[1]。紫菜属物种外形简单, 叶状体从圆形、卵圆形至长条状,长度5～35 cm。单个叶状体上又有雌性区与雄性区的分别, 叶片呈单层或双层细胞, 每个细胞含有一个或两个具有淀粉核(或蛋白核)的星状质体。所有种的紫菜均具有孢子体和配子体的异型世代交替生活史[2]。

紫菜是一类具有重要经济价值的大型海藻, 据统计, 每年紫菜总产值高达 20亿美元, 约占全世界大型海藻总产值的一半[3-5]。目前, 中国的紫菜栽培业发展迅速, 2001年后产量一直居世界第一, 已成为中国水产养殖业的支柱产业[6-7]。其中条斑紫菜(Porphyra yezoensis)是栽培面积最大、经济价值最高的种类之一。由于经济价值高, 在其生活史、生态学、生理和生化等方面已被进行了大量研究[8]。近年来,随着紫菜栽培规模不断扩大和遗传育种研究的需要,紫菜分子遗传学研究应运而生。其中, 建立在 PCR基础上的随机扩增片段长度多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)标记技术、扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)标记技术和简单序列重复(simple sequence repeats, SSR)标记技术在紫菜遗传多样性和分子系统学研究中已经得到广泛应用。

目前, 虽然已经从紫菜中克隆到了一些生理调控基因, 但仍有大量的基因未被分离鉴定出来[9], 截止到2010年10月, 在GenBank中收录的条斑紫菜的蛋白质序列(不包括EST序列)约931个, 尚不能充分了解紫菜的分子遗传学信息[10]。

建立在cDNA文库以及序列测定基础上的EST分析和基因序列的比较是当前紫菜功能基因组学研究的主要手段。迄今为止, 国内外研究者已经先后建立了条斑紫菜孢子体和配子体以及坛紫菜丝状孢子体的 cDNA文库[11-17], 并在此基础上对 cDNA克隆进行测序进而获得EST序列。目前, 在NCBI的EST数据库中可以找到22 069条条斑紫菜丝状藻丝孢子体和配子体的EST[9,12-13]。对3267个非冗余EST序列的同源比较分析结果显示, 约占分析序列 33.1%的EST序列与其他生物如高等植物、哺乳动物、酵母以及蓝细菌等相似, 其余的则为首次发现。但限于分析规模或研究目标的限制, 大部分序列测定的数量都十分有限, 还没有实质性开展包括多个生长发育时期的大规模EST测序研究。

目前, 紫菜分子生物学的相关研究结果较分散,缺乏系统性。因此有必要对其遗传背景进行更广泛和深入的系统研究, 从而更好地利用紫菜丰富的遗传资源。与陆地植物相比, 海洋藻类基因组学研究还刚刚起步, 海藻功能基因的比较基因组学研究尚未见报道。本文使用第二代高通量测序仪Solexa对条斑紫菜进行低覆盖度全基因组测序, 获取了条斑紫菜基因组大小和蛋白编码基因大小、内含子数量和大小等基因组基本特征, 为构建高质量条斑紫菜基因组精细图作了准备。

1 材料和方法

1.1 材料

条斑紫菜由江苏苏东海洋生物科技有限公司提供。

1.2 Solexa基因组文库构建和测序

提取高质量紫菜基因组 DNA(天根新型植物基因组 DNA 提取试剂盒, DP320-02, 北京)。采用Covaris™ S2 Covaris™ Inc.)超声仪进行片段化。起始量 10 μg, 用 1×low TE Buffer稀释到 300 mg/L, 参数设定如下, 20次循环×40 s, 水浴温度： 5℃, 占空比：10%, 强度： 8, 模式： Frequency sweeping。

采用NEB Next DNA Sample Prep Reagent Set1(New England biolabs Inc.)进行末端补平, 3′末端单碱基“A”加尾, Solexa测序 adapter连接和PCR富集。所有纯化步骤采用 QIAGEN公司产品。末端补平：100 μL 反应体系中, 50 μL 超声打断产物, 10 μL 10*Phosphorglation Buffer, 4μL 10*DNTP Mix (10 mmol), 5 μL T4 DNA Polymerase, 1 μL DNA Polymerase 1 (Large Fragmert), 5 μL T4 Polynucleotide Kinase, 20℃ 30 min, QIAquick PCR purification Kit纯化。末端“A”加尾, 50 μL 反应体系中, 32 μL 末端补平纯化产物, 5 μL NEB Buffer2 (Klenow exo-),10 μL DATP 缓冲液 (1mmol), 3 μL Klenow Fragment(3′-5′exo-), 37℃ 30 min, QIAgen MinElute PCR Purification Kit纯化。Solexa测序 adapter连接： 40 μL 反应体系中, 19 μL加尾纯化产物, 25 μL Quick Ligation Reaction Buffer, 1 μL, PE adapter Oligo Mix (100 μmol), 5 μL T4 DNA Ligase, 室温放置 30 min,QIAgen MinElute PCR Purification Kit纯化。连接产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离, 切取300～400 bp片段, QIAquick Gel Extraction Kit纯化。PCR 富集： 60 μL体系, 25 μL PCR Mix (DNTP, buffer, 酶), 2 μL Solexa 扩增Primer Mix (50 pmol), 33 μL胶回收产物,充分混合, PCR反应条件： 98℃ 30 s; 98℃ 10 s, 65℃30 s, 72℃ 30 s, 10 个循环; 72℃ 5 min。QIAquick PCR purification Kit纯化。纯化产物 NanoDrop™ ND-1000 (Thermo Scientific Inc.)定量后按照Solexa测序仪标准流程进行2×81双向测序[18]。

1.3 数据处理

1.3.1 数据预处理和拼接

根据 Solexa序列质量值, 去除两个或两个以上连续低质量碱基(Q值小于20), 只保留长度大于35 bp的序列。SOAPdenovo (v1.04, BGI)[19]对高质量Solexa序列进行拼接, 参数设定为： K-mer长度29bp, 文库平均插入长度300 bp, scaffolding联配长度35 bp, 其余参数默认。拼接完成后使用 gapcloser程序进行scaffold内部空洞填补。

1.3.2 基因组草图覆盖率评价

NCBI中条斑紫菜EST序列(2010年9月30日),共计22 069条[12], 对EST序列进行blat[20]自我比对,去除相似性 95%且联配比例大于 95%的冗余序列,得到非冗余EST序列15 517条,总长度7 012 808 bp。NCBI 中920条斑紫菜蛋白序列去冗余后得328条,平均长度277 aa。

统计NCBI中条斑紫菜EST和蛋白序列在contig或 scaffold上的覆盖情况评价本研究所得基因组草图的完整性。比对程序为blat[20], 只统计相似性大于95%且查询序列覆盖度大于10%的比对结果。对一条EST或蛋白序列被比对到多处基因组的情况, 只统计覆盖度最高的比对结果。

1.3.3 基因预测

使用 augustus程序[21]中自带的模型训练模块对NCBI数据库中已知紫菜属基因的 CDS序列进行训练, 生成基因预测模型, 并参考条斑紫菜已知 EST数据(22 069条), 对scaffold序列进行预测。

使用exonerate程序[22]中的protein2genome模块,将条斑紫菜已知蛋白标注到条斑紫菜基因组上, 并设定长度覆盖大于90%且得分最高的蛋白作为“成功exonerate蛋白”。预测基因与“成功 exonerate蛋白”进行基因结构比较, 检查augustus预测效果。

1.3.4 基因注释

预测基因BLAST比对NCBI nr蛋白库进行初步注释。定义BLAST比对E值小于1e-10, 且被比对蛋白长度覆盖度大于90%的对应条斑紫菜基因为“全长基因”。预测基因BLAST比对KEGG数据库[23]进行代谢途径分析, 比对参数设定E小于1e-10。

2 结果

2.1 数据预处理和拼接

质量过滤后共得55 749 075条总计4 171 821 694 bp高质量序列。SOAPdenovo程序拼接并根据序列正反向和文库大小信息构建scaffold和填补序列空洞, 结果得到长度587 042个大于100 bp的contig, 总长170 619 909 bp, N50值401 bp, 平均GC质量分数53.08%, 最大contig 44 754 bp; 370 119个scaffold总长220 854 049 bp, N50值1 317 bp, 最大scaffold 236 183 bp。

2.2 条斑紫菜基因组草图覆盖率评价

非冗余EST序列比对contig序列结果显示 (表1)： 共有 14 341条 EST 比对到 contig, 占总数的92.42%; 7 198条EST 90%以上序列被单个contig覆盖, 比例为 46.39%, 50%以上长度被覆盖的条数为12 163条, 比例为 78.38%。非冗余 EST序列比对scaffold结果显示, 共计14 307 (92.20%)条EST比对到scaffold; 10 852条EST 90%以上被单个scaffold覆盖, 比例为69.93%, 50%以上长度被覆盖的条数为13 288条, 比例为85.63%。

表1 以已知条斑紫菜EST序列评价基因组草图完整性Tab. 1 Assessment the sequence coverage of P. yezoensis genomic draft using known ESTs

非冗余条斑紫菜蛋白序列比对contig结果(表2)显示： 299个可定位到contig上, 占非冗余蛋白序列的91.16%。单个蛋白90%以上长度被单个contig覆盖的个数为171个, 比例为52.13%; 50%以上长度被单个 contig覆盖的个数为 228个, 比例为69.51%。298个非冗余蛋白比对到 scaffold, 占非冗余蛋白序列的 90.85%。单条蛋白有 90%以上长度被单个scaffold覆盖的个数为192个, 比例为58.54%; 50%以上长度被覆盖的个数为233个, 比例为71.04%。

表2 以已知条斑紫菜蛋白序列评价基因组草图完整性Tab. 2 Assessment the sequence coverage of P. yezoensis genomic draft using known proteins

条斑紫菜非冗余EST和全长已知蛋白序列覆盖度分析表明 90%以上长度定位到基因组草图的比例相对较低 (50%左右), 说明本草图至少完整覆盖了条斑紫菜基因组中全部编码编码基因中的一半, 并且总数90%以上的EST或蛋白序列可定位到基因组草图上, 表明随着 Solexa测序量的增加可以得到绝大多数完整基因序列。

2.3 基因预测

结果表明, 条斑紫菜基因组 augustus预测得26 629个“预测基因”, 总长43 407 556 bp, 平均长度1 624 bp, 编码区平均长度为1 187 bp, 其中具有内含子的基因16 409个, 占61.62%, 平均长度2 214 bp,平均每个基因含 2.22个内含子, 内含子平均长度319 bp。

exonerate结果表明, 328条非冗余紫菜蛋白序列中, 241条以≥90%蛋白长度比对到条斑紫菜基因组(称为“exonerate蛋白”), 平均长度 938 bp; 其中 78个基因带内含子, 占总数的32.37%, 平均长度1 747 bp, 内含子平均长度 260 bp, 平均每个基因含 1.89个内含子。所以从基因结构上看, 预测基因和已知条斑紫菜蛋白基本相同, 由此说明了 augustus软件进行基因预测的合理性。

2.4 基因注释

26 629条预测蛋白BLAST比对NCBI非冗余蛋白数据库(nr),E值小于等于 1e-10的蛋白条数为21 895条, 注释率为 82.22%; 进一步限定被比对nr数据库蛋白长度覆盖度≥90%, 得到高质量注释蛋白11 457条, 占43.02%。

预测蛋白BLAST比对KEGG数据库, 进行代谢途径分析, 比对参数E≤1e-10。结果发现, 26 629条蛋白中, 有 21 469条得到了 KEGG注释, 注释率80.62%, 含蛋白数目最多的前10大类 (图1)分别是：嘌呤代谢(Purine metabolism), ATP结合转运因子(ABC transporters), 嘧啶代谢(Pyrimidine metabolism), 丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism), 缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解(Valine, leucine and isoleucine degradation), 核糖体(Ribosome), 甘氨酸丝氨酸和苏氨酸代谢(Glycine, serine and threonine metabolism),双组分信号传导系统(Two-component system), 丙酸代谢(Propanoate metabolism), 丁酸代谢(Butanoate metabolism)。

图1 块结合条斑紫菜预测蛋白KEGG注释分析Fig. 1 KEGG analysis for predicted proteins of P. yezoensis

3 讨论

国际生物基因资源研究的特点, 一方面是从模式生物基因组学入手, 研究生物个体发育和系统发育的规律以及生物对环境的响应机制; 另一方面是从实际应用入手, 进行基因组序列测定, 并分离、克隆和表达有用的功能基因。自1990年人类基因组计划实施以来, 已经完成了人类、家猪、水稻、家蚕、拟南芥、酵母等50余种生物的全基因组测序工作。而在水生生物研究领域, 类似研究进展相对滞后。目前, 只在大型藻类的线粒体及叶绿体细胞器基因组结构和系统进化方面有所推进[24]。Shivji[25]在上世纪90年代初构建了条斑紫菜叶绿体基因组图谱并对其结构作了报道, Reith[26]构建了P. Purpurea的叶绿体基因组图谱, 发现有 46%的基因为陆生植物所不具备。

地球环境演变是生物类群的起源与发展的重要因素之一, 生物对环境的适应性进化以及环境变化对生物的选择, 是生物多样性发生的主要原因。大型红藻作为海洋初级生命系统中进化较为低等的水生植物, 其在形态、结构、生理和生存环境方面都与陆地植物有着很大的不同, 仅光合作用色素体一项其多样性就远高于陆地植物。因此, 国际上普遍认为,大型红藻生物学方面的研究, 在生物进化与系统演化方面具有重要的科学价值。例如,P. Purpurea的叶绿体基因组上大量的编码序列和相对很少的内含子以及操纵子序列的保守性都表明了紫菜质体基因组特有的原始特征。除了基因组中的编码区, 重复序列也逐渐引起人们的关注, 其重要特征是在进化中具有很快的演化速度, Mizukami[27]认为这些高度重复序列可以作为红藻门种系发生的一种研究工具。

条斑紫菜生活于潮间带, 周期性地经历着潮涨潮落的特殊生存条件, 特殊的生存环境孕育了独特的代谢途径, 使之拥有了多种陆生生物所不具备的特殊基因。因此有必要对紫菜的遗传背景进行更广泛和深入的系统研究, 从而更好地利用紫菜丰富的基因资源, 为我国工业、农业、药物产业服务。条斑紫菜作为我国水产业重要的经济栽培物种, 在食用及环境修复方面, 具有显著而重要的经济价值、环境价值和研究意义, 开展条斑紫菜基因组及功能基因的研究, 还将有助于培育出优质、高产、抗逆的养殖新品种, 从根本上解决海水养殖生物“质”、“量”和“病”的问题。因此, 有必要开展其基因组与功能基因研究工作, 以支撑我国生态养殖及海洋生物技术产业的可持续发展。目前NCBI公共数据库中只有931个条斑紫菜蛋白, 而本研究所得条斑紫菜基因组草图预测得到26 629个蛋白编码基因(11 457个高可信度预测基因), 证明紫菜基因组相对复杂, 所以有必要进行条斑紫菜基因组精细图谱的绘制, 使快速鉴定大部分条斑紫菜功能基因成为可能。

基因组研究模式物种选择的标准在于： 研究对象所具有的性状具有一定的代表性; 生物体便于培养, 利于研究工作的进行; 具有相关丰富的研究背景(包括生态、生理、生化以及分子生物学的一系列相关研究结果和经验); 能够充分利用现有方法和手段进行深入研究以及基因组的结构和大小[28]。由于紫菜的基因组相对较小, 大约为 2.6×108bp碱基对,代时较短, 约1～3个月就可完成一个世代, 因而, 适于基因组分析。其孢子体形式便于建立各种纯系及实验室培养, 目前关于紫菜生活史、生理生化及遗传学方面的研究以条斑紫菜居多, 并且研究也较为深入, 因而条斑紫菜一直被认为是红藻等大型藻类基因组研究较为理想的模式生物[7]。

综上所述, 开展条斑紫菜的基因组测序及绘制其精细图谱, 不仅具有重要的理论意义, 而且对于开展紫菜的遗传育种, 促进我国条斑紫菜产业的可持续发展具有指导意义。

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The analysis of the low coveragePorphyra yezoensisdraft genome

NIU Jian-feng1, GAO Sheng-han2, LUO Ying-feng2, YUAN Ye2, WANG Guang-ce1,HU Song-nian2
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Institute of Genomics,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100029, China)

Nov., 10, 2010

Porphyra yezoensis; Solexa high-throughput sequencing system; metabolic pathway

We constructed the low-coveragePorphyra yezoensisdraft genome using the Solexa high-throughput sequencing system. The predicted genome size was approximately 220 Mbp, with the GC content of 53.09%. The draft genome contained 26 629 predicted protein-coding genes, 16 409 of which had introns, averagely 2.22 introns per gene. Gene structure analysis of intron-containing genes showed that the average gene size and intron size was 2214 bp and 319 bp, respectively. Metabolic pathway analysis indicated that the purine metabolism was the largest pathway. TheP.yezoensisdraft genome constructed in this study manifested important genomic properties such as genome size and the gene structure of protein-coding gene, proving the feasibility of Solexa high-throughput system in sequencing the whole genome ofP.yezoensis.

Q949.21; Q942.4

A

1000-3096(2011)06-0076-06

2010-11-10;

2011-02-25

国家 863计划项目(2007AA09Z406); 国家自然科学基金项目(30830015); 国家973计划前期专项(2011CB411908)

牛建峰(1977-), 男, 山西榆次人, 副研究员, 主要从事藻类生理生化研究, 电话： 0532-82898575, E-mail： jf_niu@sina.com.cn;王广策, 通信作者, E-mail： gcwang@ms.qdio.ac.cn; 胡松年, 通信作者, E-mail： husn@big.ac.cn

梁德海)