不同剂量X线大分割照射对大鼠小肠的近期生物学效应

崔玉忠 安永恒 张桂芝

小肠是放射敏感的靶器官之一，肠道放射损伤与所采用的射线种类、照射剂量、照射方式及照射对象的不同有关。

Bcl-2家族基因是调控细胞凋亡最为重要的基因家族之一,Bcl-2基因是其中最具有代表性的抑制细胞凋亡的成员[1],Bax基因则是促进细胞凋亡成员的代表。尽管国内外对Bax和Bcl-2在肠组织中的表达情况已有报道,但对其结果却存在较大的争议[2]。

1 材料与方法

1.1 动物和分组

健康雄性Wistar大鼠 80只，体重为(240±20)g，由青岛药检所提供，在自然光照，室温16℃～20℃下，给予充足标准饲料及水，笼内喂养。

随机分为空白对照组(0 Gy)；照射组采用32 Gy的等效生物剂量照射，4 Gy组，每天照射1次，共照射5次；6 Gy组，每隔1天照射1次，周一、三、五，共照射3次；8 Gy组，每周照射两次，周一、三，共照射2次；12 Gy组照射1次，周一；每组有16只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 模型制作方法 大鼠用10 %水合氯醛(350 mg/ kg，腹腔注射) 麻醉后，固定于平板上，采用直线加速器(Varian 23EX型)，剂量率为300 cGy/min；使源皮距为100 cm；按照不同分组分别采用4 Gy、6 Gy、8 Gy、12 Gy的X射线进行上腹部照射(包括小肠区)，躯体的其余部位用5 cm厚的铅块屏蔽。

1.2.2 检测方法 照射组分别在照射结束后第1、3、5、7天各断头处死大鼠4只，空白对照组也同时于第1、3、5、7天各处死4只大鼠。在生理盐水冰面上开腹取距回盲部10 cm以上的回肠组织约10 cm，用10%的福尔马林液固定，常规脱水、透明、包埋,石蜡切片，分别进行HE染色及免疫组化染色，观察病理变化。鼠抗人Bcl-2、Bax单克隆抗体、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗及DAB试剂均购自北京中杉生物技术公司。采用PBS液代替一抗作为阴性对照,采用已知的阳性片作为阳性对照。具体操作按照说明书进行。

1.3 结果判定方法

结果判定参照Rahman等的标准并适当修改。阳性细胞率≤25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。根据染色强度和阳性细胞数计分之和进行判断：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～5分为阳性(++)，6～7分为强阳性(+++)。染色强度：无色0分；淡黄色1分；黄色2分；棕褐色3分。所有病理切片结果在作者与病理医师帮助下分别阅片，若有疑义共同商议后确定。

1.4 统计学方法

实验数据用率或百分比表示，采用SPSS 13.0软件进行数据处理，组间比较采用χ2检验表示，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 放疗后小肠的组织病理学变化

病理切片HE染色后,光镜下观察，与未照射组比较，所有照射组大鼠的小肠绒毛均出现不同程度缩短、数量减少,绒毛均有糜烂缺损，黏膜萎缩，溃疡形成，基底部有沟裂形成，肠上皮细胞(绒毛上皮细胞和隐窝上皮细胞)可见不同程度受损坏死。分别于照射结束后第1、3、5、7天观察，不同剂量组小肠绒毛长度、数量和坏死程度变化不大。不同剂量组间比较，以12 Gy、8 Gy组小肠绒毛损伤最为严重；4 Gy和6 Gy组次之。

2.2 Bcl-2和Bax蛋白在照射组和对照组中的表达

免疫组化染色后，光镜下可见：空白对照组中Bax蛋白均呈阳性表达，表达率为100%(16/16)，阳性表达在小肠绒毛表面黏膜上皮，下段腺管上皮细胞未见明显阳性表达，而在所有照射组中，Bax蛋白表达率均明显下降，12 Gy、8 Gy照射组，于照射后第1、3、5、7天观察，Bax蛋白均呈阴性表达，阳性率均为0(0/16)；与空白对照组比较，差异有显著统计学意义(P<0.001)，而4 Gy、6 Gy照射组，同样于照射后第1、3、5、7天观察，Bax蛋白阳性率为25%(4/16)；与空白对照组比较，差异有显著统计学意义(P<0.001)。而12 Gy、8 Gy照射组与4 Gy、6 Gy照射组组间比较，差异无统计学意义(P=0.101)，见表1，表明未照射组小肠组织中Bax蛋白表达显著强于照射组小肠组织，而照射组间其表达未见明显差异。

表1 各组细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达情况(只)

在空白对照组中，Bcl-2蛋白不仅表达于小肠表面黏膜上皮细胞胞质中，下段腺管上皮细胞胞质也可见其阳性表达，这与Bax表达情况不完全相同，阳性表达率为100%(16/16)。而在所有照射组中Bcl-2蛋白表达均明显下降，12 Gy、8 Gy照射组，于照射后第1、3、5、7天观察，均呈阴性，阳性率均为0(0/16)；与空白对照组比较，差异有显著统计学意义(P<0.001)。4 Gy、6 Gy照射组，同样于照射后第1、3、5、7天观察，阳性率均为25%(4/16)；与空白对照组比较，差异有显著统计学意义(P<0.001)。而12 Gy、8 Gy照射组与4 Gy、6 Gy照射组组间比较，差异无统计学意义(P=0.101)。表明未照射组小肠组织中Bcl-2蛋白表达显著强于照射组小肠组织，而照射组间其表达未见明显差异，见表1。

3 讨论

电离辐射可引起生物体损害。消化道，尤其是小肠，对放射线高度敏感。放辐射损伤后，肠道黏膜屏障功能减弱甚至消失，肠道细菌及细胞分解产物进入血循环后引起的菌血症和毒血症是重要致死因素。

肠道上皮组织是1种更新快的组织，平均3～5天就要更新1次[3]，对放疗化疗包括分子靶向治疗都非常敏感。电离辐射可以通过杀伤肠道黏膜上皮细胞和隐窝干细胞从而破坏肠道的吸收和屏障功能，致使绒毛上皮的更新缺乏来源，进而破坏其结构和功能的完整性，导致肠腺存活率降低[4]。

Bcl-2和Bax基因属于Bcl-2基因家族的重要成员，Bcl-2是研究最早的与凋亡有关的基因，也是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族，Bax是凋亡诱导基因,往往与Bcl-2以二聚体的形式存在于细胞内，Bcl-2/Bax比率是影响细胞凋亡的关键。Bcl-2可能在抑制细胞凋亡的同时，缩短细胞周期。从而促进肿瘤生长，这提示Bcl-2蛋白高表达与不良的临床生物学行为有关。Bax基因具有促进细胞凋亡的功能，是Bcl-2的显性抑制因子。细胞凋亡受到抑制会导致自身免疫性疾病或肿瘤等；而不恰当的激活会发生组织器官的退行性病变或早衰[5]。

近年来许多学者指出，X刀立体定向治疗与常规放疗相比，可以提高靶区的精确性，提高肿瘤控制率，保护周围正常组织，降低并发症，其优越性尤为明显[6]。但如何最大限度的降低放疗并发症，保护正常组织，需要我们在以后的临床和基础工作中逐步完善。

通过我们的试验结果可以看出，采用等效生物剂量为32 Gy的X线照射后，大鼠小肠均出现不同程度放射性损伤，在光镜下观察小肠损伤的程度，其中以12、8 Gy组损伤最为严重；4 Gy和6 Gy组次之；分析造成这个结果的原因：小肠为早反应组织，缩短总治疗时间会加重对早反应组织的放射性损伤；12 Gy组仅在周一照射1次，8 Gy组在周一、三共照射2次；而4 Gy组和6 Gy组在周五照射结束；虽然大鼠在放疗前进行了麻醉及固定等措施，但放疗前的摆位、照射野的范围、放疗的次数等因素也会对照射结果产生一定影响。

从实验的免疫组化结果分析：大鼠采用大分割放疗后，小肠Bcl-2和Bax基因的表达均比未照射组降低。分析其中可能的原因：由于我们采用的照射剂量较大，小肠绒毛损伤较严重，因此，各照射组主要表达于小肠绒毛表面黏膜上皮的Bax基因阳性率出现明显降低；Bcl-2基因不仅出现在小肠表面黏膜上皮细胞胞质中，且在下段腺管上皮细胞胞质也可见表达，因12、8 Gy照射组小肠绒毛损伤最严重，因此这两组中Bcl-2和Bax基因的表达均为阴性；而4、6 Gy组中小肠的损伤相对较轻，因此，在这两组中会有Bcl-2和Bax基因表达的阳性大鼠。

综上所述，我们的研究发现，大鼠采用大分割放疗后，小肠Bcl-2和Bax基因的表达水平均下降，与未照射组比较有统计学意义，但是要进一步明确细胞凋亡及相关蛋白的表达与放射性损伤发生和发展的关系，还亟需更多的临床和基础研究来进一步完善。

[1]Sambaziotis D，Kapranos N，Kontogeorgos G.Correlation of b-cl-2 and bax with apoptosis in human pituitary adenomas〔J〕.Pituitary，2003,6(3)：127.

[2]彭 立,欧阳淼.大肠黏膜癌变过程中cox-2,bcl-2 及Bax 表达的相关性〔J〕.医学临床研究,2007,24(7):1140.

[3]Brittan M,Wright NA.Stem cell in gastrointestinal structure and neoplastic development〔J〕.Gut,2004,53(6):899.

[4]Fowler JF，Harari PM，Leborgne F，et al.Acute radiation reactions in oral and pharyngeal mucosa: tolerable levels in altered fractionation chedules〔J〕.Radiother Oncol，2003，69(2):161.

[5]Kam PC,Ferch NI.Apoptosis: mechanisms and clinical implications〔J〕.Anaesthesia,2000,55(11):1081.

[6]蒋国樑.束流调强的适形放疗〔J〕.中国癌症杂志,2008,18(6):466.