HPLC-RI法测定胃蛋白酶中糖的不确定度评定

谢贞建,颜 军,何 钢,苟小军

(成都大学中药化学实验室,四川成都 610106)

0 引 言

测量不确定度,是指表征合理地赋予被测量值的分散性,与测量结果相关联的参数[1],它是对测定结果的不可信程度或对测定结果有效性的怀疑程度.不确定度越小,测量结果的质量越高,使用价值越大.由于被测量的真值难以准确复现,因此科学合理地进行测量结果不确定度的分析,并将其应用于测定结果的评定中,对于提高检测结果的质量,降低误判风险具有重要现实意义[2].本文依据《化学分析测量不确定度评定》(JJF 1135-2005)对HPLC-RI法测定胃蛋白酶中糖的不确定度进行评定分析,拟为含量测定数据的分析与测量结果的准确性和可信度的评判提供一种科学的依据.

1 材料、仪器与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料.

实验材料包括:葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品(分析纯,成都科龙化工试剂厂),胃蛋白酶片(重庆格瑞林药业有限公司),复方胃蛋白酶颗粒(重庆申高生化制药有限公司),乙腈(色谱纯,四川航嘉生物医药科技有限责任公司).

1.1.2 实验仪器.

实验仪器包括:L-2000高效液相色谱仪、L-2490示差折光检测器(日立公司),T15RT台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司),K Q3200超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司),分析天平(北京赛多利斯天平有限公司).

1.2 实验方法

1.2.1 标准储备液的配制.

分别精确称取5 g(精确至0.0001 g),经过95℃±2℃干燥2 h的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准品,加适量78%乙腈溶解,转移到100 mL容量瓶中,用78%乙腈定容至刻度,摇匀,备用.

1.2.2 混标配制.

分别取等量配制好的葡萄糖、蔗糖、麦芽糖标准储备液于容量瓶中,78%乙腈定容至刻度,0.45μm微孔膜过滤,备用.

1.2.3 样品溶液的配制.

精确称量研磨成粉末的样品0.5 g(精确至0.0001 g),加去离子水10 mL溶解后转移到试管中,于沸水浴中加热10 min,冷却后离心(10 000 r/min,10 min),转移到50 mL容量瓶中,用78%乙腈定容至刻度,0.45μm滤膜过滤,入样品瓶中供液相色谱测定. 1.2.4 色谱条件.

实验的色谱条件为:色谱柱为Sugar D(4.6 mm× 250 mm,5μm),流动相为乙睛+水(78∶22),流速1.0 m L/ min,柱温30℃,检测器池温度35℃,进样量20μL.

2 测量不确定度评定

2.1 数学模型

采用HPLC-RI法测定胃蛋白酶中糖的不确定度评定的数学模型为,

式中:X为样品中被测组分含量,g/100 g;C为从标准曲线上所得被测组分溶液浓度,mg/mL;V1为样品溶液定容体积,mL;m为样品的质量,g.

2.2 不确定度来源分析[3-5]

从实验的测定过程和所确定的数学模型分析, HPLC-RI法测定胃蛋白酶中糖含量的不确定度的主要来源包括:标准物质、定容体积、样品称量、分析仪器、样品重复检测等.

2.3 不确定度分量的量化

2.3.1 标准不确定度.

因标样中各物质的标准偏差,S=0.01%(n= 5),服从正态分布,则由此引起的标准不确定度,U1=0.01/5=4.5×10-3(B类),自由度,v1=4.

2.3.2 标样(试样)溶液峰面积的相对标准不确定度 U2(U3).

U2(U3)主要由进样定量环体积、容量瓶和刻度移液管体积的标准不确定度共同引起.

进样定量环进样体积的不确定度为1%,若按均匀分布的规律考虑,其标准不确定度,U21=U31=0.01/3=5.8×10-3(B类),自由度,v21=v31=∞.

容量瓶的制造误差为,2×10-3,服从正态分布,则溶液稀释时引起的标准不确定度,U22=U32= 1.4×10-3(B类)(k=3),自由度,v22=v32= ∞.

刻度移液管的分度值为0.01 mL,若按三角分布的规律考虑,其置信区间的半宽度为,α=0.005 mL,k=61/2,则其标准不确定度,U23=U33=0.005/ 6=2.1×10-3(B类),自由度,v23=v33= ∞.

故,

2.3.3 标样(试样)质量的相对标准不确定度U4(U5).

U4(U5)由天平不确定度和标样(试样)称重读数重复性不确定度组成.

由检定证书中查得天平不确定度,U99=0.0002 g(k=3),服从正态分布,则其标准不确定,U41= U51=6.7×10-4(B类),自由度,v41=v51= ∞.

称重时,重复称量10次,得极差为0.0002 g,按极差法计算其标准不确定度,U42=U52=2.1× 10-5(A类),自由度,v42=v52=9.

故,

其中,m1和 m2分别代表标样和试样的质量.

2.3.4 测量误差引起的不确定度U6.

同一浓度样品重复测量6次,得其测量误差为4.0%,按极差法计算其标准不确定度,U6= 0.04/2.83=1.4×10-2,自由度,v6=5.

2.3.5 重复性引起的不确定度分量U7.

重复进样6次,其相对标准偏差为1.6%,则重复性引起的不确定度分量,U7=0.016/6×1.3= 8.5×10-3,自由度,v7=5.

2.3.6 仪器不稳定、环境温度及检测器灵敏度等不确定度.

对于仪器不稳定、环境温度和检测器灵敏度所带来的不确定度,可将其纳入测定重复性的不确定度中.而湿度所带来的不确定度,可并入质量的不确定度中.

2.4 合成标准不确定度评定

合成标准不确定度,

自由度,

2.5 扩展不确定度评定

取置信概率,p=95%,按有效自由度,v=15,查 t分布表得,tp=t95=2.13,则扩展不确定度,

2.6 各相对标准不确定度分量所占比例

各相对标准不确定度分量所占比例如表1所示.

表1 各相对标准不确定度所占比例

3 讨 论

本文通过实验分析得出的扩展不确定度为4.1%,表明结果较为准确可靠,证明HPLC-RI法可用于胃蛋白酶中糖的不确定度评定.

由实验结果可以看出,在引起胃蛋白酶中糖含量测定的不确定度中,测量误差和重复性所带来的不确定度所占比例较大,说明仪器本身的不稳定性以及环境温度的变化是影响不确定度的主要因素.这可能与示差折光检测器的检测原理和环境温度变化有很大的关系.首先,示差折光检测器对温度变化很敏感,在实验过程中由于环境温度变化使流动相在进入检测池时的温度不一样,进而导致折射率改变,造成基线的噪声增大和基线漂移.因此,在实验过程中应控制环境温度保持不变,且环境温度与检测池池体的温差不应超过10℃.其次,流动相组成的任何变化都会对实验有明显的影响,由于示差折光高效液相色谱法不能使用梯度洗脱,因此,一旦色谱条件选定后,最好将流动相按需要预混合好后再由单泵输送.同时,系统应充分平衡,以减小因基线漂移等带来的定量误差.

总之,在实验过程中,应保证测量环境的温度恒定和系统充分平衡,并通过增加测定次数来减小测量结果的不确定度.

[1]国家标准物质研究中心.JJF 1135-2005 化学分析测量不确定度评定[S].北京:国家质量监督检验检疫总局, 2005.

[2]王承忠.测量不确定度的验证方法及其应用实例[J].理化检验(物理分册),2008,44(10):296-298.

[3]邓自西.气相色谱法和高效液相色谱法分析中不确定度的评定[J].色谱,2004,22(5):568.

[4]颜斌,曹军,陈勇,等.高效液相色谱/串联质谱法测定水产品中环丙沙星的不确定度[J].检验检疫学刊,2011,21 (2):40-43.

[5]张春雨,姜义,李壮.高效液相色谱法测定饮料中糖精钠的不确定度分析[J].中国卫生工程学,2010,9(6):466-467.