21种中草药提取物对MRSA的抗菌作用研究

傅若秋，余 琼，孟德胜，卢来春，张雪梅（.第三军医大学第三附属医院，重庆市40004；.西南大学园艺园林学院，重庆市 40075；3.重庆医科大学医学检验系，重庆市 40006）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是严重影响人类健康，导致坏死性肺炎、严重败血症、坏死性筋膜炎等疾病的重要致病菌[1]，如何防治已成为全球关注的焦点。万古霉素是临床上唯一确证对MRSA有效的药物，但目前许多国家（包括中国）均发现了对万古霉素耐药的MRSA[2]。一旦MRSA发展到对万古霉素普遍耐药，MRSA感染患者将面临无药可治的危险境地，因此研究开发针对MRSA的新的抗菌药物刻不容缓。天然植物特别是中草药中蕴含着多种多样的天然活性物质，从中筛选抗MRSA药物是一个很好的途径。笔者在对21种中草药提取物进行筛选时发现其中8种具有抗MRSA作用，故对其进行了抗菌活性的初步研究。

1 材料

1.1 琼脂平板与培养基

血琼脂平板（CN）、M-H琼脂平板（重庆庞通医疗器械有限公司）；Luria-Bertani培养基（LB，笔者配制，LB配方：酵母提取物5 g，蛋白胨10 g，氯化钠10 g，pH7.2～7.4）。

1.2 药敏纸片

万古霉素、头孢西丁、苯唑西林、头孢呋辛、四环素、替考拉宁、氯霉素、利福平、红霉素、头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、庆大霉素、克林霉素药敏纸片均购自英国Oxoid公司。

1.3 中草药

蒲公英（Taraxaci Herba）、桑叶（Morus alba）、夏枯草（Prunella vulgaris）、半枝莲（Scutellaria barbata）、木瓜（Chaenomeles sinensis）、仙鹤草（Agrimonia pilosa）、大血藤（Sargentodoxa cuneata）、侧柏叶（Platycladus orientalis）、黄芪（Astragali Radix）、三七（Panax notoginseng）、白花蛇舌草（Oldenlandia diffusa）、淫羊藿（Epimedii Folium）、皂角刺（Gleditsia sinensis）、茵陈（Artemisiae Scopariae Herba）、陈皮（Citrus reticulata）、葛根（Pueraria lobata）、菊花（Chrysanthemum morifolium）、枇杷叶（Eriobotrya japonica）、大蓟（Cirsium japonicum）、党参（Codonopsis Radix）、紫苏（Perilla frutescens）均由第三军医大学第三附属医院中草药房提供，由笔者鉴定为真品。

1.4 菌种

MRSA临床分离菌株（第三军医大学第三附属医院检验科惠赠）。

2 方法

2.1 水提物的制备

称取每种中草药各10 g，分别加100 mL纯化水浸泡24 h，在电热帽中加热煎煮0.5 h，收集滤液，滤渣再加100 mL纯化水加热煎煮0.5 h，重复3次，合并滤液，过滤，浓缩至浓度为1 g·mL-1（以1 mL药液含生药量1 g计），灭菌后4℃贮藏，备用。临用前取出，在无菌操作台上用无菌纯化水倍比稀释至0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，备用。

2.2 醇提物的制备

称取每种中草药各10 g，分别用95%乙醇150 mL浸泡7 d，共浸泡3次，过滤，合并滤液，回收乙醇，制成浸膏，用无菌纯化水[含5%二甲基亚砜（DMSO）]配成浓度为1 g·mL-1（以1 mL药液含生药量1 g计）的药液，灭菌后4℃贮藏，备用。临用前取出，在无菌操作台上用无菌纯化水（含5%DMSO）倍比稀释至0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1，备用。

2.3 菌液的制备

将菌种接种于含LB培养基的试管中，于37℃培养约24 h，用培养基调整其OD值为0.8，再用培养基稀释1 000倍，相当于菌液浓度为105～106cfu·mL-1，备用。

2.4 抑菌试验

2.4.1 MRSA耐药性鉴定 采用K-B纸片扩散法测试MRSA对不同抗菌药的敏感性。将菌液100µL均匀涂于M-H琼脂平板上，待干后，分别贴上万古霉素、头孢西丁、苯唑西林、头孢呋辛、四环素、替考拉宁、氯霉素、利福平、红霉素、头孢唑啉、环丙沙星、左氧氟沙星、青霉素、庆大霉素、克林霉素药敏纸片，于37℃恒温孵育24 h，测定抑菌环的大小，判断其对药物的敏感性。

2.4.2 初筛 于无菌96孔板中每孔加入菌液190µL和浓度为1 g·mL-1的中草药提取物10µL，每种中草药提取物重复3次；另取菌液190µL、无菌纯化水10µL作为阳性菌对照；取培养基190µL、无菌纯化水10µL作为阴性菌对照。于37℃培养24 h，肉眼观察培养液澄清者，表明其对应的中草药提取物有抑菌作用，用于后续试验。

2.4.3 中草药提取物抑菌/杀菌作用 于无菌96孔板中每孔加入菌液190 µL，分别加入浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 g·mL-1初筛有效的中草药提取物10µL（相当于培养体系中提取物浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563 mg·mL-1），每种中草药提取物每个浓度重复3次；另取菌液190µL、无菌纯化水10µL作为阳性菌对照；取培养基190µL、无菌纯化水10µL作为阴性菌对照。于37℃培养24 h，肉眼观察培养液澄清者表明所对应浓度的中草药提取物有抑菌作用。将肉眼观察到的澄清培养液取20µL转种至血平板中，于37℃培养24 h后观察结果，血平板中无细菌生长所对应浓度的中草药提取物表明其有杀菌作用。计算不同浓度中草药提取物对11株MRSA的抑菌率和杀菌率。

3 结果

3.1MRSA耐药性鉴定

用头孢西丁纸片扩散法来检测金黄色葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，可作为临床实验室确证MRSA的一种简便有效的方法[3]。采用NCCLS判断标准[4]，11株MRSA均对苯唑西林、头孢西丁、青霉素耐药，符合MRSA的判断标准；此外，11株MRSA对其他β-内酰胺类、头孢菌素类、喹诺酮类、大环内酯类、氨基糖苷类等常见抗生素均不同程度耐药，符合MRSA多重耐药特征。11株MRSA对常见抗生素的耐药情况分析见表1（S：敏感；M：中介；R：耐药）。

表1 11株MRSA对常见抗生素的耐药情况分析Tab 1 Drug resistance of 11 strains of SRSA against common antibiotics

3.2 初筛结果

21种中草药中有8种对MRSA具有较强的抗菌活性，分别为半枝莲、仙鹤草、蒲公英、夏枯草、桑叶、木瓜、侧柏叶、大血藤。

3.3 抑菌/杀菌作用测定结果

3.3.1 抑菌作用测定结果 8种中草药提取物均对11株MRSA具有抑菌作用，在50 mg·mL-1浓度下对11株MRSA的抑菌率均达到100%，但在1.563 mg·mL-1浓度下对MRSA均无抑菌作用（表中略去）。其中，半枝莲水提物、仙鹤草醇提物的抑菌作用较强，在6.25 mg·mL-1浓度下对11株MRSA的抑菌率仍达100%，结果见表2。

表2 8种中草药不同浓度提取物对11株MRSA的抑菌作用测定结果Tab 2 Antibacterial effects of 8 extracts of Chinese herbal medicine with different concentrations on 11 strains of MRSA

3.3.2 杀菌作用测定结果 8种中草药提取物均对11株MRSA具有一定的杀菌作用，其中仙鹤草醇、水提物和半枝莲、蒲公英、侧柏叶的醇提物在50 mg·mL-1浓度下对11株MRSA的杀菌率可达100%；仙鹤草水提物在25 mg·mL-1浓度下对11株MRSA的杀菌率可达100%；但所有提取物在≤3.125 mg·mL-1浓度时对MRSA均无杀菌作用。其中，半枝莲水提物与仙鹤草醇、水提物的杀菌作用较强，在6.25 mg·mL-1浓度下对11株MRSA的杀菌率分别为18.2%、45.5%、45.5%，结果见表3。

表3 8种中草药不同浓度提取物对11株MRSA的杀菌作用测定结果Tab 3 Bactericidal effects of 8 extracts of Chinese herbal medicine with different concentrations on 11 strains of MRSA

4 讨论

21种中草药中，有8种中草药的水提物和醇提物对MRSA均有抑制作用，其中仙鹤草醇、水提物和半枝莲、蒲公英、侧柏叶的醇提物具有较强的杀菌作用。

由试验结果可见，同一中草药的醇提物和水提物其抑菌作用可能差别很大，有的醇提物抑菌作用强于水提物，如木瓜同等浓度（12.5 mg·mL-1）醇提物抑菌率为90.9%，其水提物抑菌率为45.5%；而有的水提物作用强于醇提物，如蒲公英同等浓度下（6.25 mg·mL-1）水提物抑菌率为81.8%，其醇提物抑菌率仅为9.1%。而不同中草药提取物间的抑菌作用差别就更大，如在3.125 mg·mL-1浓度下，半枝莲醇提物和水提物的抑菌率分别达到36.4%和81.8%，而其他大多数中草药提取物在此浓度下未表现出抑菌活性。

由于各中草药提取物中所含组分、提取收率等均不尽相同，因此抗菌浓度大小的差异并不能完全真实反映各提取物所含活性成分之间的作用强度差异。尽管如此，笔者也能从抑菌率/杀菌率结果中判断出该提取物是否有明显的抗MRSA活性。

[1] Maree CL，Daum RS，BoyleVavra S，et al.Community-associated methicillin-resistant staphylococcus aureus isolates causing healthcare-associated infections[J].Emerg-ing Infect Dis，2007，13（2）：236.

[2] 谢绍华，王小华，许 鹏，等.耐万古霉素MRSA重症肺炎1例报告[J].江西医药，2010，45（3）：231.

[3] 谌秋华，范丛进.耐甲氧西林金葡菌的头孢西丁检测法与耐药性分析[J].中国抗生素杂志，2005，30（11）：672.

[4] NCCLS.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[S].Ninteen the Informational Supplement，2009，29（3）：47.