一种中国南海海绵Xestospongia testudinaria中化学成分的研究＊

孔雯雯，韩 磊，李 亮，邵长伦，章 蓉，Nicole J.de Voogd ，王长云＊＊

（1.中国海洋大学医药学院，海洋药物教育部重点实验室，山东青岛266003；2.Netherlands Centre for Biodiversity Naturalis，p.o.box 9517，2300 ra leiden，Netherlands）

一种中国南海海绵Xestospongia testudinaria中化学成分的研究＊

孔雯雯1，韩 磊1，李 亮1，邵长伦1，章 蓉1，Nicole J.de Voogd2，王长云1＊＊

（1.中国海洋大学医药学院，海洋药物教育部重点实验室，山东青岛266003；2.Netherlands Centre for Biodiversity Naturalis，p.o.box 9517，2300 ra leiden，Netherlands）

综合运用正相和反相硅胶柱层析、Sephadex LH－20凝胶柱层析以及制备HPLC等分离方法，从1种中国南海海绵Xestospongia testudinaria中追踪分离抗肿瘤活性次级代谢产物。从95%乙醇提取物中分离获得8个单体化合物，通过NMR，MS等波谱技术鉴定其结构分别为：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸甲酯（1），E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸乙酯（2），麦角甾－5，7，22－三烯－3－醇（3），麦角甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮（4），胆甾－4－烯－3－酮（5），3－吲哚醛（6），3－吲哚酸（7）和5－吲哚醛（8）。其中，化合物2－5和8为首次从该属海绵中分离得到。化合物1对肿瘤细胞株HCT116和A549显示较强的抑制活性。

海绵；Xestospongia testudinaria；化学成分；分离；结构鉴定

桶状海绵Xestospongia testudinaria属于寻常海绵纲（Demospongiae），单骨海绵目（Haplosclerida），Petrosiidae科，Xestospongia属。文献报道从该属海绵中分离得到的次级代谢产物主要为卤代脂肪酸，甾体，萜类和生物碱等［1－5］。本研究在对中国南海海绵X.testudinaria的粗提物及各有机相进行活性筛选时发现，乙酸乙酯相具有细胞毒和卤虫致死活性，进而对该相进行活性追踪分离，并鉴定单体化合物的结构，分别确定为：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸甲酯（1），E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸乙酯（2），麦角甾－5，7，22－三烯－3－醇（3），麦角甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮（4），胆甾－4－烯－3－酮（5），3－吲哚醛（6），3－吲哚酸（7）和5－吲哚醛（8）（见图1）。对以上化合物的细胞毒和卤虫致死活性进行测定，发现化合物1对人结肠癌细胞HCT116和人肺腺癌细胞A549的增殖具有较强的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桶状海绵X.testudinaria（Lamarck，1815）样品于2006年4月采自中国南海临高邻昌礁海域，标本保存于中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室（HNLCJ－20060001），由荷兰国家自然历史博物馆Nicole J.de Voogd博士鉴定（RMNH POR.5230）。

Micromass Q－TOF质谱仪；JEOL JEM－ECP600核磁共振波谱仪；Bruker DRX－400核磁共振波谱仪；高效液相色谱仪（Waters公司）（1525泵，2996二极管阵列检测器，717自动进样器）；色谱柱：Kromasil C18，7μm，10×250 mm；Sephadex LH－20为Pharmacia公司产品；柱层析硅胶（200－300目）和薄层层析硅胶（GF254）为青岛海洋化工厂产品。

1.2 提取与分离

新鲜海绵样品（干质量680 g），切碎后于室温下用95%乙醇超声浸提4次（4×1 000 m L），过滤，合并提取液，将浸膏分散于400 m L水中，依次用等体积的乙酸乙酯和正丁醇分别萃取6次，各萃取液减压浓缩后，得乙酸乙酯相浸膏（9.7 g）和正丁醇相浸膏（6.5 g）。

乙酸乙酯相显示一定的细胞毒和卤虫致死活性，在100μg／mL时对人肺腺癌细胞A549抑制率为45%，对卤虫的致死率为40%。乙酸乙酯相浸膏经硅胶柱层析，石油醚－乙酸乙酯梯度洗脱，分为8个组分（Fr.1～8）。Fr.2组分对A549的抑制率在100μg／m L时为65%。Fr.4和Fr.7组分在100μg／m L时致死率分别为25%和40%。经反复的硅胶柱层析、凝胶柱层析及半制备HPLC的分离纯化，从Fr.2组分获得化合物1（9.6 mg），2（7.8 mg）和5（10.0 mg），从Fr.4组分中得到化合物3（500.0 mg）和4（50.0 mg），从Fr.7组分中分离得到化合物6（7.4 mg），7（11.2 mg）和8（4.1 mg）。

1.3 生物活性测定

细胞毒活性选用人肺腺癌细胞A549，人白血病细胞HL60和人结肠癌细胞HCT116，采用MTT法测定［6］。卤虫致死活性采用卤虫Artemia salina，按照Solis改良法［7－9］测定。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

通过活性追踪分离的方法，从桶状海绵X.testudinaria提取物的乙酸乙酯相中分离鉴定了8个化合物（见图1），包括2个含溴多烯炔化合物，3个甾体化合物和3个吲哚衍生物。

图1 化合物1－8的结构Fig.1 Structures of compounds 1－8

化合物1 无色油状物。ESI－MS在m／z 443与465处分别给出［M＋H］＋准分子离子峰与［M＋Na］＋峰，同时在m／z445和447，以及467和469处给出与分子离子峰等高的同位素峰，提示该化合物含有两个溴原子。结合其1HNMR谱，13CNMR和DEPT谱确定分子式为C19H24Br2O2，具有7个不饱和度。1HNMR谱低场区给出2个相互偶合的烯氢信号δ6.37（1H，dt，J＝16.0，7.1 Hz），5.47（1H，d，J＝16.0 Hz）及1个孤立的烯氢信号δ6.27（1H，t，J＝7.1 Hz），结合13CNMR和DEPT谱信息，确定该分子中有2个双键的存在。而13CNMR谱低场区给出1个酯羰基信号δ175.0。由此判断该化合物中成环或含有其他类型的不饱和键才能符合7个不饱和度。在氧原子数目已定的前提下，13CNMR谱δ89.0，82.3，74.5和66.9被确定为4个炔碳信号，为分子式贡献了剩余的4个不饱和度。另外，1HNMR谱高场区δ2.48（2H，t，J＝7.4 Hz），2.37（2H，dt，J＝6.9，1.0 Hz），2.18（2 H，q，J＝7.2 Hz）和2.12（2 H，dq，J＝7.1 Hz）处分别为与酯羰基和不饱和键相连的亚甲基氢信号，δ3.67（3H，s）提示分子有甲氧基的存在。综合以上

波谱数据，并与文献［5］对照，确定化合物1的结构为：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸甲酯。波谱数据：1HNMR（400 MHz，CDCl3，TMS，δ）：6.37（1 H，dt，J＝16.0，7.1 Hz，H－10），6.27（1 H，t，J＝7.1 Hz，H－17），5.47（1H，d，J＝16.0 Hz，H－9），3.67（3H，s，H－OCH3），2.48（2H，t，J＝7.4 Hz，H－2），2.37（2 H，dt，J＝6.9，1.0 Hz，H－4），2.18（2 H，q，J＝7.2 Hz，H－16），2.12（2H，dq，J＝7.1，1.5，Hz，H－11）；13CNMR（100 MHz，CDCl3，TMS，δ）：175.0（C，C－1），148.0（CH，C－10），139.1（CH，C－17），109.0（CH，C－9），89.0（C，C－5），82.3（C，C－6），74.5（C，C－7），66.9（C，C－8），51.6（CH3，COMe），32.9（CH2，C－2），32.8（CH2，C－11），32.2（CH2，C－16），28.5（CH2，C－12），28.5（CH2，C－13），28.2（CH2，C－14），27.4（CH2，C－15），23.4（CH2，C－3），18.6（CH2，C－4）；ESI－MS m／z：447／445／443［M＋H］＋469／467／465［M＋Na］＋。

化合物2 无色油状物。与化合物1的1HNMR谱对比，显示2个化合物结构极为相似，不同之处在于化合物2少了δ3.67处的甲基信号峰，而在δ4.17和1.21处分别多了2个氢信号和1个甲基信号。结合质谱ESI－MS给出的m／z 483／481／479［M＋Na］＋峰，确定化合物2与化合物1的差别在于乙氧基取代了甲氧基连接于酯羰基处。综合以上信息，并与文献［5］对照，确定化合物2的结构为：E－18，18－二溴－9，17－二烯－5，7－二炔硬脂酸乙酯。波谱数据：1HNMR（400 MHz，CDCl3，TMS，δ）：6.37（1 H，dt，J＝16.0，7.1 Hz，H－10），6.27（1H，t，J＝7.1 Hz，H－17），5.47（1H，d，J＝16.0 Hz，H－9），4.17（2 H，q，J＝7.6 Hz，HOEt），2.48（2 H，t，J＝7.4 Hz，H－2），2.37（2 H，dt，J＝6.9，1.0 Hz，H－4），2.18（2 H，q，J＝7.2 Hz，H－16），2.12（2H，dq，J＝7.1，1.5，Hz，H－11），1.21（3 H，t，J＝7.6 Hz，H－OEt）；ESI－MS m／z：483／481／479［M＋Na］＋。

化合物3 白色粉末。化合物1HNMR谱高场区δ1.0～2.2处给出甾体特征的亚甲基信号峰，以及两个角甲基信号δ0.63（3H，s）和0.94（3H，s），甾体支链上4个裂分为d峰的特征甲基信号δ0.82（3 H，d，J＝6.5 Hz），0.85（3 H，d，J＝6.5 Hz），0.92（3 H，d，J＝6.5 Hz）和1.03（3H，d，J＝6.5 Hz）。化学位移δ3.63（1H，m）处为甾醇C－3位连氧碳上的氢信号。低场区δ5.57（1 H，d，J＝5.5 Hz），5.34（1 H，d，J＝5.5 Hz）为一对顺式偶合的双键氢信号。δ5.23（1 H，dd，J＝15.1，7.3 Hz）和5.16（1 H，dd，J＝15.1，7.8 Hz）为一对反式偶合的双键氢信号。以上分析结合文献［10］，确定化合物3为麦角甾－5，7，22－三烯－3－醇，核磁数据：1HNMR（600 MHz，CDCl3，TMS，δ）：5.57（1H，d，J＝5.5，H－6），5.34（1 H，d，J＝5.5 Hz，H－7），5.23（1H，dd，J＝15.1，7.3 Hz，H－23），5.16（1H，dd，J＝15.1，7.8 Hz，H－22），3.63（1H，m，H－3），1.03（3H，d，J＝6.5 Hz，H－21），0.94（3 H，s，H－19），0.92（3H，d，J＝6.5 Hz，H－28），0.85（3H，d，J＝6.5 Hz，H－27），0.82（3H，d，J＝6.5 Hz，H－26），0.63（3H，s，H－18）。

化合物4 无色片状晶体。1HNMR谱也显示出甾体化合物的波谱特征信号，包括2个角甲基信号δ1.02（3H，s），1.01（3H，s），和甾体支链上4个裂分为d峰的特征甲基信号δ1.09（3H，d，J＝6.7 Hz），0.95（3H，d，J＝6.8 Hz），0.87（3H，d，J＝6.8 Hz），0.85（3H，d，J＝6.8 Hz）。另外1HNMR谱低场区给出2个顺式偶合的双键氢信号δ6.66（1H，d，J＝9.5 Hz）和6.10（1H，d，J＝9.5 Hz），2个反式偶合的双键氢信号δ5.32（1 H，dd，J＝15.2，7.3 Hz）和5.27（1H，dd，J＝15.2，7.9 Hz）以及1个孤立的烯氢信号δ5.65（1 H，s）。结合13CNMR和DEPT谱数据分析，化合物5可能为含有4个双键的不饱和甾体。

结合ESI－MS的分析，m／z 393处的［M＋H］＋准分子离子峰确定了该化合物的分子式为C28H40O。13CNMR谱信号δ197.3提示分子中含有酮羰基，而季碳δ163.3可能与羰基碳处于同一共轭体系导致其向低场位移，即该化合物具有不饱和酮的结构片段。以上数据与文献［11］报道数据一致，确定化合物4为麦角甾－4，6，8（14），22－四烯－3－酮。波谱数据：1HNMR（600 MHz，CDCl3，TMS，δ）：6.66（1H，d，J＝9.5 Hz，H－7），6.10（1H，d，J＝9.5 Hz，H－6），5.65（1H，s，H－4），5.32（1H，dd，J＝15.2，7.3 Hz，H－23），5.27（1 H，dd，J＝15.2，7.9 Hz，H－22），1.09（3 H，d，J＝6.7 Hz，H－21），1.02（3H，s，H－19），1.01（3 H，s，H－18），0.95（3 H，d，J＝6.8 Hz，H－28），0.87（3H，d，J＝6.8 Hz，H－27），0.85（3H，d，J＝6.8 Hz，H－26）；13CNMR（150 MHz，CDCl3，TMS，δ）：197.3（C，C－3），163.3（C，C－5），155.3（C，C－14），135.4（CH，C－22），133.4（CH，C－7），132.3（CH，C－23），124.6（C，C－8），124.6（CH，C－6），122.9（CH，C－4），55.8（CH，C－17），44.6（CH，C－9），43.9（C，C－13），43.0（CH，C－24），39.4（CH，C－20），36.7（C，C－10），35.8（CH2，C－12），34.1（CH2，C－1），33.9（CH2，C－2），33.1（CH，C－25），27.7（CH2，C－16），25.0（CH2，C－15），20.9（CH3，C－21），19.6（CH3，C－27），19.2（CH3，C－26），18.9（CH2，C－11），18.5（CH3，C－18），17.3（CH3，C－28），16.1（CH3，C－19）；ESI－MS m／z：［M＋H］＋393。

化合物5 无色油状物。ESI－MS m／z 407［M＋Na］＋给出相对分子量为384，1HNMR在高场区δ1.00～2.10处给出甾体骨架的多个亚甲基信号，且δ1.17（3 H，s）和0.70（3 H，s）处的2个甲基为甾体特征的C－18，C－19位角甲基信号，δ0.96（6 H，d，J＝6.5 Hz），0.93（3H，d，J＝6.5 Hz）亦为甾体支链上特征的甲基信号，另外1HNMR谱在低场区还给出1个烯氢信号δ5.72（1 H，s）。综合以上分析，并与文献［12］对照，确定化合物5为胆甾－4－烯－3－酮。核磁数据：1HNMR（600 MHz，CDCl3，TMS，δ）：5.72（1H，s，H－4），1.17（3H，s，H－19），0.96（6H，d，J＝7.0 Hz，H－26，27），0.93（3H，d，J＝6.5 Hz，H－21），0.70（3 H，s，H－18）；ESI－MS m／z：407［M＋Na］＋。

化合物6 白色粉末。1HNMR谱给出了4个芳香环上的烯氢信号δ8.15（1H，brd，J＝7.0 Hz），7.46（1 H，brd，J＝7.5 Hz）和7.25（2 H，m），提示分子中可能存在邻位双取代的苯环。另外还给出1个醛基氢信号δ9.87（1 H，s）。而ESI－MS给出的144［M－H］－准分子离子峰，根据氮规则推测化合物中存在氮原子。由此推断该化合物可能为芳香生物碱类化合物。以上数据与文献［13］报道数据一致，确定化合物6为3－吲哚醛。波谱数据：1HNMR（400 MHz，CD3OD，TMS，δ）：9.87（1 H，s，H－10），8.15（1 H，brd，J＝7.0 Hz，H－4），8.09（1H，s，H－2），7.46（1H，brd，J＝7.5 Hz，H－7），7.25（2 H，m，H－5，6）；ESI－MS m／z：144［M－H］－。

化合物7 白色粉末。与化合物6的1HNMR谱进行比较，化合物7少了δ9.87处的醛基氢，结合ESI－MS谱图给出的m／z 160［M－H］－准分子离子峰，参照文献［14］，确定该化合物为3－吲哚酸。波谱数据：1HNMR（400 MHz，CD3OD，TMS，δ）：8.08（1 H，m，H－7），7.87（1H，s，H－2），7.42（1H，m，H－4），7.17（2 H，m，H－5，6）；ESI－MS m／z：160［M－H］－。化合物8 淡黄色油状物。ESI－MS给出准分子离子峰m／z 144［M－H］－，提示该化合物与化合物6具有相同的分子式，故与化合物6的1HNMR进行比较，δ10.08（1H，s）表明醛基仍存在，但其位置发生了改变。通过计算偶合常数，发现化合物8的苯环区只有3个芳香氢信号δ8.32（1 H，dd，J＝7.0，2.4 Hz），7.85（1 H，t，J＝2.4 Hz），7.44（1H，d，J＝7.1 Hz），由此推断醛基取代了苯环上5位或6位的芳香氢。以上数据与文献［15］报道一致，确定化合物8为5－吲哚醛。波谱数据：1HNMR（400 MHz，CDCl3，TMS，δ）：10.08（1H，s，H－10），8.32（1H，dd，J＝7.1，2.4，H－6），7.85（1H，t，J＝2.4，H－4），7.44（1 H，d，J＝7.1，H－7），7.36（1H，m，H－2），7.30（1H，m，H－3）；ESI－MS m／z：144［M－H］－。2.2生物活性测定

卤虫致死活性测定发现，化合物1－8对卤虫A.salina显示弱的或无致死活性。细胞毒活性测试显示，化合物1对人结肠癌细胞HCT116和人肺腺癌细胞A549的增殖具有抑制作用，IC50分别为8.1和6.3 μg／m L。

本研究采用活性追踪分离的方法，从中国南海桶状海绵X.testudinaria中分离鉴定了8个化合物。其中，化合物2－5和8为首次从该属海绵中分离得到。结合文献［3］推测，2个含溴的多烯炔化合物1和2为该属海绵中特征性的次级代谢产物。化合物1显示出较强的抗肿瘤活性，为该海绵样品的活性次级代谢产物及药物发现研究提供了基础资料。

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Chemical Constituents of Sponge Xestospongia testudinaria from the South China Sea

KONG Wen－Wen1，HAN Lei1，LI Liang1，SHAO Chang－Lun1，ZHANG Rong1，Nicole J.de Voogd2，WANG Chang－Yun1
（1.The Key Laboratory of Marine Drugs，Ministry of Education，School of Medicine and Pharmacy，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Netherlands Centre for Biodiversity Naturalis，p.o.box 9517，2300 ra leiden，the Netherlands）

The chemical constituents of sponge Xestospongia testudinaria from the South China Sea were investigated by bioassay－guided fractionation.Eight compounds were isolated from 95%ethanolic extract by repeated column chromatography on silica gel and Sephadex LH－20，and preparative－HPLC.By means of spectroscopic data including NMR and MS，their structures were elucidated as E－9，17－octadecadiene－5，7－diynoic acid－18，18－dibromo－methyl ester（1），E－9，17－octadecadiene－5，7－diynoic acid－18，18－dibromoethyl ester（2），ergosta－5，7，22－trien－3－ol（3），ergosta－4，6，8（14），22－tetraen－3－one（4），cholest－4－en－3－one（5），1 H－indole－3－carboxaldehyde（6），1 H－indole－3－carboxylic acid（7）and 1 H－indole－5－carboxaldehyde（8）.Compounds 2－5 and 8 were reported from genus Xestospongia for the first time.Moreover，compound 1 showed potent cytotoxicity towards tumor cell lines HCT116 and A549.

sponge；Xestospongia testudinaria；chemical constituents；isolation；structure elucidation

Q959.120.6

A

1672－5174（2011）11－086－05

国家自然科学基金项目（40776073；30901879）；国家科技基础性工作专项（2007FY210500）；国家教育部高等学校博士学科点专项（20090132110002）资助

2011－01－15；

2011－09－02

孔雯雯（1987－），女，硕士生。E－mail：enga87＠163.com

＊＊通讯作者：E－mail：changyun＠ouc.edu.cn

责任编辑 徐 环