藜蒿绿原酸的提取及抗脂质过氧化作用研究

2011-01-07刘胜贵胡朝暾

怀化学院学报 2011年5期

付明, 夏伟, 刘胜贵, 胡朝暾

(怀化学院民族药用植物资源研究与利用湖南省重点实验室;湘西药用植物与民族植物学湖南省高校重点实验室; 生命科学系,湖南怀化 418008)

藜蒿 (Artemisia selengensis Turcz)即狭叶艾,又称蒌蒿、柳蒿等,菊科蒿属多年生草本植物.分布在我国江西、湖南、湖北、安徽等省,生长于湖边、沼泽等地,其中蛋白质含量为3.7%、钙0.73%、抗坏血酸0.049%、胡萝卜素0.004%、铁0.003%.藜蒿主治五脏邪气、风寒湿脾,长毛发、防衰老,健胃、降血压、防癌等效果明显[1].其地上嫩茎和地下匍匐茎可食用,由于风味独特,成为人们喜爱的野生蔬菜.对藜蒿的研究主要集中在栽培、保鲜以及食用加工等方面,其次是抗氧化作用.目前藜蒿大棚种植技术已非常成熟,加深对藜蒿的药用保健功能的开发正成为研究热点.

绿原酸作为一种抗氧化剂能清除自由基,有抗菌消炎、抗病毒、降糖、降血脂、保肝利胆等功效[2-6].目前对金银花、杜仲、忍冬等中药材的绿原酸提取工艺研究较多,提取绿原酸的方法有醇提法[7-8]、酶解法[9]、超声波提取法[10]等.绿原酸在327nm处有最大光吸收,因此常采用紫外分光光度法测定其含量.

过氧化脂质 (LPO)的积累会诱发炎症、免疫失调、动脉粥样硬化和恶性肿瘤等.检测LPO的方法[11-12]有硫代巴比妥酸 (TBA)法、荧光法、硫代巴比妥钠法.绿原酸能抑制靶分子的自动氧化,是许多中药材的主要药用成分.因此了解藜蒿中绿原酸的含量、研究绿原酸抗脂质过氧化作用对藜蒿药用成分的研究具有一定的意义.采用硫代巴比妥钠法测定LPO,对比研究藜蒿绿原酸与抗坏血酸 (Vc)的抗脂质过氧化作用.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藜蒿采自湖南省怀化市.将藜蒿茎放入干燥箱中,65℃干燥后粉碎、过100目筛,保存备用.小鼠由怀化学院实验室小鼠养殖房提供.

绿原酸标准品 (中国药品生物制品检定所110753-200413),硫代巴比妥钠、甲醇、三氯乙酸 (TCA)、抗坏血酸等均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 藜蒿绿原酸提取工艺的优化

1.2.1.1 样品的制备

取藜蒿粉1.000 g于50 ml锥型瓶中,加入20 ml 70%的甲醇溶液,用0.1 mol/L HCl调pH至3.0,70℃下浸提2 h,再用超声波 (400 W)处理30 min后抽滤,用氯仿萃取滤液,取上层液旋转蒸发浓缩,再用70%甲醇定容至50 ml,待测.

1.2.1.2 最大吸收波长、标准曲线及回归方程的建立

配制0.40 mg/mL绿原酸标准溶液.取绿原酸标准液和藜蒿提取液各0.5 ml分别置于10 ml容量瓶中,加70%甲醇定容至刻度,摇匀静置10 min,对绿原酸标准液和藜蒿提取液于200～500 nm下扫描.选取二者共同的最大吸收波长,测定不同浓度标准液的吸光值,制作标准曲线,得回归方程.

1.2.1.3 藜蒿绿原酸含量的测定

取藜蒿粉1.000 g于锥形瓶中加入一定体积一定浓度的甲醇溶液,调至一定pH值,于一定温度下处理2 h,再用超声波处理30 min后抽滤,将滤液旋转蒸发浓缩后定容至50 ml.取0.5 ml提取液用甲醇定容至10 ml,静置10 min后测A327.根据吸光值通过回归方程求出X,再按公式 (1)计算绿原酸质量分数：

(X：按回归方程求得的绿原酸浓度;n：稀释倍数;W：所取藜蒿粉质量)

1.2.1.4 提取绿原酸的单因素试验

取藜蒿粉1.000 g于锥形瓶中按1.2.1.3的方法提取绿原酸,分别考察甲醇浓度、料液比、温度、pH四个因素对藜蒿绿原酸含量的影响.甲醇浓度分别为40%、50%、60%、70%、80%,料液比分别为1：10、1：15、1：20、1：25、1：30,pH值分别为1.5、3.0、4.5、6.0、7.5,温度分别为40、50、60、70、80℃.根据测得的A327通过回归方程和公式 (1)计算绿原酸含量.试验重复三次.

1.2.1.5 绿原酸提取工艺的正交试验

在单因素试验基础上,采用L9(34)正交表对上述四个因素进行正交试验,试验重复四次.

1.2.2 藜蒿绿原酸抗脂质过氧化作用研究

1.2.2.1 组织匀浆的制备

小鼠禁食24 h后脱臼处死,取出肝脏用冷生理盐水漂洗后,加入生理盐水在冰浴中进行匀浆制成5%的肝匀浆.

1.2.2.2 绿原酸与抗坏血酸抗脂质过氧化作用的对比研究

取1.0204 g藜蒿粉在最佳提取工艺下提取绿原酸,蒸发浓缩后用生理盐水定容至10 ml,相当于1 mg/ml的绿原酸.将试管分为对照组、抗坏血酸组和藜蒿提取液组.先向每支试管分别加入肝匀浆0.5 ml,然后分抗坏血酸组、藜蒿提取液组和对照组,以硫代巴比妥钠法测A532,并按公式 (2)计算不同浓度的样品和抗坏血酸对LPO生成的抑制率.试验重复三次.

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长、标准曲线及回归方程

紫外分光光度计对绿原酸标准品和藜蒿提取液的扫描结果见图1,从图中可以看出藜蒿提取液在250～400 nm处的波峰比较单一,说明纯度较高,并且二者在327 nm处都有最大吸光值,故选定测定波长为327 nm.然后分别测定不同浓度的标准绿原酸溶液的A327,以A327对绿原酸标准品浓度绘制标准曲线,得回归方程A=52.701X+0.0109,相关系数R2=0.9997,说明在绿原酸浓度为0.004～0.020 mg/mL时线性关系良好.

2.2 提取绿原酸的单因素试验结果

在甲醇浓度、料液比、pH、温度四个单因素试验中,除了变动的单因素外其他条件均不变;完成一项单因素试验后,在考察另一个单因素时该条件就选择已经确定的最佳条件.甲醇浓度、料液比、pH、温度对绿原酸的提取率的影响分别见图2～5.

图1 藜蒿提取液和绿原酸标准品扫描图

图2 甲醇浓度对绿原酸含量的影响

由图2看出,当甲醇浓度在40%～60%之间时,绿原酸含量随之增加,当浓度超过60%后绿原酸含量上升不明显.至70%甲醇以后绿原酸含量甚至有所降低,可能是随着甲醇浓度的增加,藜蒿中其他一些物质溶出影响了A327.因此确定70%为最佳提取浓度.

图3 料液比对绿原酸含量的影响

由图3看出,在料液比为1∶10～1∶20时,绿原酸含量随甲醇用量增加而升高,当料液比大于1∶20时,绿原酸含量增加较为缓慢,至料液比为1∶25时含量最高 (0.95%).再增加甲醇用量,含量基本不变.考虑成本因素,甲醇用量选20倍于干物料为佳.

图4 pH值对绿原酸含量的影响

由图4可知,pH大于3.0时,绿原酸含量随着pH值的增大而降低.当pH大于6.0时,下降幅度明显增大,原因可能是绿原酸对碱不稳定.故pH为3.0左右时提取效果较好.

由图5可知,当温度在40～70℃之间时,绿原酸含量随浸提温度的升高而增加;当温度大于70℃时,绿原酸含量反而下降,可能是绿原酸分解了.由此确定最佳浸提温度为70℃.

图5 温度对绿原酸含量的影响

2.3 提取绿原酸的正交试验结果

采用L9(34)正交试验测定藜蒿中绿原酸的含量,按表1操作浸提藜蒿绿原酸,结果见表1.

表1 L9(34)正交试验结果

由表1可知,各因素对超声波辅助浸提藜蒿绿原酸的影响程度为C(温度)>D(pH)>A(甲醇浓度)>B(料液比).根据直观分析,甲醇浓度为75%、料液比为1∶25、温度为70℃、pH为3.0即A3B3C2D2为最佳提取工艺.

按表1确定的最佳提取工艺进行验证性实验,绿原酸平均含量为0.98%.

2.4 藜蒿绿原酸与VC抗脂质过氧化作用的对比试验结果

藜蒿绿原酸与Vc抗脂质过氧化作用的对比试验结果见图6.

从图6可知,当浓度较低时 (0.01～0.2 mg/ml),藜蒿绿原酸与Vc抗脂质过氧化作用随浓度的增加而增强.在相同浓度下藜蒿绿原酸的抗脂质过氧化作用明显强Vc,说明藜蒿提取液具有很强的抗脂质过氧化能力.

图6 绿原酸和Vc对小鼠肝脏LPO生成的影响

3 结论与讨论

通过单因素试验和正交试验,确定采用超声波辅助甲醇浸提法提取藜蒿绿原酸的最佳工艺为甲醇浓度75%,料液比1∶25,提取温度70℃,pH为3.0,此时藜蒿绿原酸的平均含量为0.98%.有关藜蒿绿原酸含量的报道很少,郑鄂湘用乙醇回流法提取藜蒿绿原酸、高效液相色谱法测其含量,在最佳提取工艺下藜蒿绿原酸含量为1.24%.这与实验材料、提取方法和测定方法不同有关.

关于藜蒿抗脂质过氧化作用的研究目前尚未见报道,杨安树等[14]采用Rancimat法研究了藜蒿提取物的抗氧化作用,发现藜蒿提取物对油脂具有明显的抗氧化作用,且具有剂量效应关系;在乳化体系中提取物的抗氧化效果比在油体系中强.本研究证明藜蒿绿原酸对脂质过氧化作用具有较强的抑制作用,且具有剂量效应.而且藜蒿提取物比Vc具有更强的抗氧化作用,因而是一种具有开发潜力的抗氧化剂.

藜蒿是药食两用的植物,保健价值高,在人们越来越重视健康和生活质量的现代社会具有广阔的应用前景.不断加深对藜蒿药用成分,如黄酮、挥发油、绿原酸等的研究正成为目前藜蒿研究的热点.藜蒿饮料、藜蒿精油、藜蒿粉等保健产品的开发市场潜力较大.

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