e NOS基因27bp VNTR多态性与新疆哈萨克族和汉族原发性高血压的对比分析

张 强，邓峰美，刘 成，何 芳，王 刚，邹放君，卢贤贵，钟 华，唐 斌

（1石河子大学医学院病理生理学教研室／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002；2石河子大学医学院第一附属医院，石河子832002）

e NOS基因27bp VNTR多态性与新疆哈萨克族和汉族原发性高血压的对比分析

张 强1，邓峰美1，刘 成2，何 芳1，王 刚1，邹放君1，卢贤贵1，钟 华1，唐 斌2

（1石河子大学医学院病理生理学教研室／新疆地方与民族高发病教育部重点实验室，石河子832002；2石河子大学医学院第一附属医院，石河子832002）

探讨内皮型一氧化氮合酶基因27bp VNTR多态性与新疆哈萨克族和汉族原发性高血压的相关性研究。运用多重单碱基延伸分型技术（Multiplex SNapshot）对新疆哈萨克族363例高血压患者和370例健康对照，汉族346例高血压患者，385例健康对照进行e NOS基因27bp VNTR多态性分型，比较基因型、等位基因在病例和对照组中的分布频率及同一基因型、等位基因频率在两民族间的差异性及与原发性高血压（EH）的相关性。结果显示：（1）哈萨克族人群中检测到4种基因型bb、aa、ab、bc，EH 组及对照组中的分布频率分别为78.5%、78.6%；1.9%、1.1%；19.0%、20.0%；0.6%、0.3%，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。等位基因b、a、c在 EH 组和对照组中分布频率分别为88.3%、88.8%；11.4%、11.1%；0.3%、0.1%，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；（2）汉族对照组中检测到四种基因型bb、aa、ab、bc，未在EH组检测到bc基因型，EH组及对照组中的分布频率分别为80.3%、79.5%；0.9%、1.0%；18.8%、19.2%；0%、0.3%，组间差异无统计学意义（P＞0.05）。等位基因b、a、c在 EH 组和对照组中分布频率分别为89.7%、89.2%；10.3%、10.6%；0%、0.2%，组间差异无统计学意义（P＞0.05）；（3）e NOS基因27bp VNTR位点基因型及等位基因在汉族与哈萨克族总人群、高血压及非高血压人群中差异无统计学意义（P＞0.05）。新疆哈萨克族和汉族居民e NOS基因27bp VNTR多态性与原发性高血压不相关。

原发性高血压；内皮型一氧化氮合酶；多态性；哈萨克族；汉族

原发性高血压（essential hypertension，EH）是最常见的心血管疾病，是一类由多基因和环境因素共同作用而引起的一种严重影响人类生命健康的慢性复杂遗传性疾病。目前，研究已证实一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L－精氨酸的氧化反应生成一氧化氮（nitric oxide，NO），NO可介导平滑肌细胞舒张，是调节血管张力的重要信使分子［1］，血浆中NO的水平异常被认为可以导致慢性高血压病［2］的发生。目前对于内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，e NOS）基因27 bp数目可变串联重复序列（27bp VNTR）多态性的研究较多。e NOS基因定位于7q35～36区，含有26个外显子和25个内含子，位于第4内含子27bp VNTR根据重复次数不同，通常有2种等位基因，重复4次为a等位基因，重复5次为b等位基因。虽然大多数风险等位基因在群体中的发病频率都很低，但是在新疆哈萨克族所居住的生活环境以及饮食结构的特殊性的共同影响下，可能这种微效基因的作用会表现出来，所以本研究选取同居地的汉族人加以对比，进一步阐明微效基因作用模式在EH遗传机制中所起的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象

采取分层整群抽样，选取新疆天山北麓塔城地区沙湾县博尔通古乡牧区，下西湾村、加尔苏瓦提村、阔克黑牙村、齐勒窝则可村、喀拉巴斯陶村18岁以上的哈萨克族及汉族居民进行流行病学调查。原发性高血压样本采集采用世界卫生组织（WHO）关于高血压病的诊断标准：收缩压≥140 mmHg（1 mm Hg＝0.133 k Pa）或舒张压≥90 mm Hg，排除继发性高血压、心肌病、瓣膜性心脏病、先天性心脏病、肝肾功能不全、孕妇、哺乳期及口服避孕药妇女。共抽取哈萨克族和汉族EH患者分别为363例、346例作为病例组，非高血压的哈萨克族和汉族分别为370例、385例作为健康对照组。

1.2 研究指标

采用问卷调查收集人口资料，按标准、规范的方法测量研究对象坐位血压、身高、体重、腰围（WC）、臀围（HC），并计算了体重指数（BMI）和腰臀比（WHR）；实验室检查有空腹血糖、胆固醇、低及高密度脂蛋白、肌酐、尿酸，载脂蛋白等，测定由石河子大学第一附属医院检验科协助完成，检测仪器为O－ly mpus AU2700全自动生化仪。

1.3 检测eNOS基因多态性

1.3.1 基因组DNA的提取

抽取空腹血液标本10 mL，用肝素（生化检查）和EDTA抗凝管（DNA提取）分离血样。采用经典的酚－氯仿法进行DNA提取，将抽提的DNA和标准分子量mar ker进行电泳，再使用Quantity One软件标化mar ker电泳条带，然后去比对每个DNA样本的亮度，DNA浓度标化至25 ng／μL。

1.3.2 引物设计与PCR反应

PCR引物序列利用在线Pri mer 3.0软件设计，上 游 引 物：5’－TATGGTAGTGCCTTGGCTGGA－3’；下 游 引 物：5’－TGCTCCTGCTACTGACAGCAC－3’，（上海生工生物工程技术服务有限公司合成）。20μL的PCR反应体系：DNA模板1μL、10×buffer 2μL、Mg Cl21.2μL、d NTP 0.6μL、PCR引物2μL、Hotstar Taq聚合酶0.2μL、去离子水13μL。利用ABI公司的2720 Ther mal Cycler预变性94℃5 min后，继之进行35个循环，每个循环94℃变性30 s，59℃退火40 s，72℃延伸45 s，最后72℃持续10 min延伸。

1.3.3 基因型分析

取PCR扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外凝胶成像仪成像，鉴定PCR产物。应用 Multiplex SNaPshot技术进行基因分型，荧光PCR产物上ABI3130XL测序仪，取0.5μL纯化后的延伸产物，与0.5μL Liz500 SIZE STANDARD，9μL Hi－Di混匀，95℃变性5 min后上ABI 3130XL测序仪。采用Gene Mapper 4.0软件对ABI 3130XL测序仪中所得原始数据进行分析。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0统计学软件对数据进行分析，以Har dy－Weinberg平衡检验确认研究样本的群体代表性，计数资料采用χ2检验、计量资料采用t检验等，危险因素与EH的关系研究采用l ogistic回归分析。

2 结果与分析

2.1 研究对象一般情况及临床生化指标比较

两个民族中，EH组的收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体质指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、肌酐、尿酸均高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05），高密度脂蛋白、载脂蛋白－A1、载脂蛋白－B的差异无统计学意义（P＞0.05）。而年龄、空腹血糖、甘油三酯在哈萨克族人群中两组间差异有统计学意义（P＜0.05）（表1）。

表1 新疆哈萨克族和汉族研究对象临床生化指标比较Tab.1 Clinical parameters of essential hypertension and control subjects in the Han and Kazakh population in Xinjiang

表1 新疆哈萨克族和汉族研究对象临床生化指标比较Tab.1 Clinical parameters of essential hypertension and control subjects in the Han and Kazakh population in Xinjiang

注：“＊”表示差异有统计学意义。

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2.2 哈萨克族及汉族人群27bp VNTR基因型分布的Hardy－Weinberg平衡检验

两民族e NOS基因27bp VNTR基因Hardy－Weinberg平衡检验结果见表2。高血压组、对照组、总人群的基因型分布均符合Hardy－Weinberg平衡（P＞0.05），提示该人群有较好的代表性（表2）。

表2 哈萨克族和汉族人群27bp VNTR基因型分布的Hardy－Weinberg平衡检验Tab.2 Hardy－Weinberg of e NOS genotypes in the Han and Kazakh population in Xinjiang

2.3 27bp VNTR基因型及等位基因在新疆哈萨克族和汉族人群中EH组与对照组的分布

27bp VNTR基因型及等位基因在新疆哈萨克族和汉族EH组与对照组间的分布见表3。由表3可见：在哈萨克族人群中检测到4种基因型bb、aa、ab、bc，在EH组及对照组中的分布分别为285例（78.5%）、291例（78.6%）；7例（1.9%）、4例（1.1%）；69例（19.0%）、74例（20.0%）；2例（0.6%）、1例（0.3%），组间差异无统计学意义（P＞0.05）。等位基因b、a、c在EH组和对照组中分布频率分别为641例（88.3%）、657例（88.8%）；83例（11.4%）、82例（11.1%）；2例（0.3%）、1例（0.1%），组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

在汉族对照组中检测到4种基因型bb、aa、ab、bc，未在EH组检测到bc基因型，EH组及对照组中的分布分别为278例（80.3%）、306例（79.5%）；3例（0.9%）、4例（1.0%）；65 例（18.8%）、74 例（19.2%）；0例（0%）、1例（0.3%），组间差异无统计学意义（P＞0.05）。等位基因b、a、c在EH 组和对照组中分布频率分别为621例（89.7%）、687例（89.2%）；71 例 （10.3%）、82 例 （10.6%）；0 例（0%）、1例（0.2%），组间差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 27 bp VNTR基因型及等位基因在新疆哈萨克族和汉族EH组与NT组中的分布Tab.3 Frequency distribution of e NOS genotypes and alleles in the Han and Kazakh population in Xinjiang EH and NT group subjects

2.4 总人群、高血压组与对照组e NOS基因27bp VNTR位点在哈萨克族和汉族间基因型与等位基因频率分布的比较

从表4可以看出：e NOS基因27 bp VNTR位点基因型及等位基因型频率在汉族与哈萨克族人群中差异无统计学意义（P＞0.05）。高血压组与对照组分组后，仍未发现该位点基因型及等位基因型频率在汉族与哈萨克族人群中存在统计学差异（P＞0.05）。

表4 总人群、高血压组和对照组eNOS基因27bp VNTR位点哈萨克族和汉族基因型与等位基因频率的比较Tab.4 Comparison of genotype and allele frequencies eNOS gene 27 bp VNTR sites in the whole population，essentidl hypertensions and no－hypertensions

2.5 logistic回归分析

以是否有高血压作因变量，年龄、体重指数、腰臀比、空腹血糖、胆固醇、甘油三酯、载脂蛋白、尿酸、肌酐、基因型等为自变量进行多因素Logistic回归分析，结果显示：在两民族中体重指数增大、血脂异常为原发性高血压发生的独立危险因素，而e NOS基因27 bp VNTR多态性与高血压无关。

表5 原发性高血压与相关因素的Logistic回归分析Tab.5 Logistic regression analysis of relating factors with essential hypertension

3 讨论

原发性高血压是一种常见的慢性疾病，目前对于EH的病因及其发病机制尚未完全清楚。其属于多基因、多因素以及环境因素交互作用而引起的复杂性疾病。新疆哈萨克族是中国高血压高发民族之一，大量研究表明哈萨克族青少年的血压高于同龄的其他民族，而且成人高血压的患病率明显高于同一居住地的汉族人群，在本质上体现出遗传因素的存在，同时也与他们高盐、高脂饮食，缺少蔬菜摄入密不可分。为此本研究选择尽量两民族间一般情况均衡，更能充分的说明遗传因素的作用。两民族的指标如收缩压、舒张压、平均动脉压、脉压、体重指数、腰臀比、胆固醇、低密度脂蛋白、肌酐、尿酸均高于对照组，作为原发性高血压的影响因素，在两民族间都存在，与邓峰美等［3］、Chang等［4］的相关研究报道一致。进一步进行l ogistic回归分析，校正了年龄、性别、体重指数及临床生化指标的混杂影响，结果显示，体重指数增大、血脂异常为两居民原发性高血压的共同独立危险因素，与原发性高血压的发生密切相关。

在本研究的检测过程中，发现了第4内含子27bp VNTR除了存在4～5次重复外，还有重复6次的，记为c等位基因。汉族对照组中发现携带c等位基因1例，哈萨克族对照组1例，高血压组2例，未见到在其他不同地区或不同民族的报道。哈萨克族人群中bb、aa、ab、bc等4种基因型和等位基因b、a、c在EH组及对照组中的分布频率差异无统计学意义（P＞0.05）。汉族EH组未检测到bc基因型，EH组及对照组基因型和等位基因的分布频率差异无统计学意义（P＞0.05）。目前有关报道发现e NOS基因27bp VNTR携带［5］a等位基因与升高的舒张压和平均动脉压有关，Jemaa等［6］发现e NOS基因ab与突尼斯人高血压直接相关，在我国路萍等［7］研究北京地区EH患者，发现e NOS基因27bp VNTR重复a等位基因的人具有患原发性高血压的一定危险性。但也有一些研究报道却与此不同，如，Yokoyam等［8］研究了京都人，未发现e NOS的等位基因与血压相关，同与我国新疆地区对哈萨克族人群的研究结果一致［9－10］，也与本课题哈汉民族对比的研究结果相一致。由此，可以推断e NOS基因第4内含子可能在不同人群中对于高血压遗传的微效基因作用有所不同。而与心血管相关的其他疾病如冠心病的研究报道见文献［11－12］，其对我国汉族人的研究发现a等位基因是本地区民族的遗传危险因子。在国外的研究中，对于ab基因型的结论也不一致，高加索人群的研究中有与冠心病相关的［13］，也有不相关的［14］。而在亚洲韩国人群 Par k等［15］的研究认为a等位基因能显著升高冠心病的发病危险性。e NOS基因多态性与高血压、冠心病等心血管疾病关系的研究结果很不一致。可能的解释为：1）基因突变存在着种族、环境及地理因素的差异，这说明基因的分布在各种人群中是不一致的，那么与疾病相关的基因突变也会有差异；2）疾病本身的复杂性，不是一种基因突变可以解释的。高血压病以及冠心病是多种基因及环境因素间相互作用导致的复杂病理过程，单纯的突变并不能决定疾病的发生。

e NOS基因分布存在种族和地域的差异性，多态性位点在不同地域不同人群的基因频率分布也不同。在本研究中，e NOS基因27bp VNTR位点基因型及等位基因型频率在汉族与哈萨克族总人群、高血压组与对照组分组后的各人群中，未发现该位点基因型及等位基因型频率在两民族居民中有统计学意义（P＞0.05）。可能在新疆哈汉两民族间高血压患者e NOS基因27bp VNTR位点的多态性不存在遗传学的差异。

综上所述，超重、肥胖及血脂代谢紊乱与EH有密切的关系，所以合理的饮食、保持良好的体型对于减缓EH的发病率有重要意义。在两民族e NOS基因的对比研究中，发现民族间27bp VNTR多态性存在基因型的不同，但未有遗传学的差异。消除了性别、体重指数等对于血压的混杂影响后，在新疆哈萨克族和汉族人群中未发现e NOS基因27bp VNTR多态性与EH有相关性。

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Association of the Poly mor phisms f or the e NOS Gene 27bp VNTR with the Essential Hypertension bet ween Kazak and Han Population in Xinjiang

ZHANG Qiang1，DENG Feng mei1，LTU Cheng2，HE Fang1，WANG Gang1，ZOU Fangjun1，LU Xiangui1，ZHONG Hua1，TANG Bin2
（1 Depart ment of pathophysiology；Shihezi Medical University／Key Laboratory of Xinjiang Endemicand Ethnic Diseases；Shihezi 832002，China；2 First Affiliated Medical Hospital of Medical College，Shihezi Uniuersity，Shihezi 832002，China）

To study correlation bet ween the endothelial nitric oxide synthase gene 27bp VNTR poly morphism and essential hypertension in Xinjiang Kazak and Han people we used Multiplex SNaPshot to compare Kazakh 363 hypertensive patients and 370 healthy people，346 Han patients with hypertension and 385 healthy people，and the genotype and allele in cases and controls the frequency of essential hypertension were compared.The result showed that（1）Among Kazaks were detected f our genotypes bb，aa，ab，bc，and distribution of frequencies were 78.5%，78.6%；1.9%，1.1%；19.0%，20.0%；0.6%，0.3%in EH group andcontrol group，it wasn’t significanted difference bet ween the groups（P＞0.05）.Alleles b，a，c in EH group and control group，distribution of frequencies were 88.3%，88.8%；11.4%，11.1%；0.3%，0.1%，it wasn’t significanted difference bet ween the groups（P＞0.05）.（2）Detected among Han population were four genotypes bb，aa，ab，bc，but didn’t detect bc in the EH group genotype，EH group and control group in the distribution of frequencies were 80.3%，79.5%；0.9%，1.0%；18.8%，19.2%；0%，0.3%，it wasn’t significance difference bet ween the groups（P＞0.05）.Alleles b，a，c in the EH group and control group，distribution of frequencies were 89.7%，89.2% ；10.3%，10.6%；0% ，0.2% ，it wasn’t significant difference bet ween the groups（P＞0.05）.（3）27bp VNTRe NOS gene genotypes and alleles was not significance difference in the Han and Kazak population.The poly morphism of e NOS 27bp VNTR may not be associated with essential hypertension in Kazakh and Han population of Xinjiang.

essential hypertension；endothelial nitric oxide synthase；polymorphism；Kazak；Han

R554.101

A

1007－7383（2011）05－0592－06

2011－05－24

国家自然科学基金项目（30860102，30860079）

张强（1984－），男，硕士生，专业方向为心血管疾病的发生机制；e－mail：zhqiang120＠126.com。

唐文武（1967－），男，副主任医师，从事心血管疾病的发病机制研究；e－mail：tanbing＠yahoo.com.cn。