荧光定量PCR法检测益生菌饮料中Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9

其木格苏都，王记成，张家超，张和平

（1.青岛君益食品有限公司，山东 青岛 266107 2.内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

荧光定量PCR法检测益生菌饮料中Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9

其木格苏都1，王记成2，张家超2，张和平2

（1.青岛君益食品有限公司，山东 青岛 266107 2.内蒙古农业大学 乳品生物技术与工程教育部重点实验室，呼和浩特 010018）

益生菌活菌数是益生菌产品最重要的指标，而检测益生菌方法的准确性和科学性则至关重要。本文采用荧光定量PCR法同时定量检测益生菌饮料中Lactobacillus casei Zhang（L.casei Zhang）和Bifidobacterium lactis V9（B.lactis V9）的活菌数，并与平板菌落计数法进行比较。结果表明，荧光定量PCR法测得L.casei Zhang活菌数与平板菌落计数法测得活菌数差异不显著；而采用荧光定量PCR法测得B.lactis V9活菌数显著高于平板菌落计数法。荧光定量PCR法灵敏、特异、简便快速，可定量检测并真实反应L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌数。

荧光定量PCR；菌落计数

0 引 言

益生菌在产品中的存活与否及其存活的数量是其发挥生理功效的前提。准确科学的检测其活菌数至关重要。荧光定量PCR方法检测多菌复合发酵样品中特定菌株，检测效率高，特异性和敏感性强，已经被应用于乳酸菌的定量研究中[1]。

Lactobacillus caseiZhang（L.caseiZhang）分离自传统发酵酸马奶（koumiss）[2]。大鼠和小鼠模型试验、人体试验以及基因组学和蛋白组学试验研究显示，L.casei Zhang具有良好的益生特性[3-9]。Bifidobacterium lactis V9（B.lactis V9）分离自健康蒙古族儿童粪便中[10]。临床研究表明，其对便秘和急慢性腹泻患者治疗效果显著[11]。

本文以L.casei Zhang和B.lactis V9双联益生菌共生发酵制得的豆乳饮料——百益多为样本，采用荧光定量PCR法检测二者的活菌数，并与平板菌落计数法比较，探寻更准确适合的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样品：瓶装“百益多”活性益生菌豆乳饮料。

药品：TaKaRa-PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser（大连宝生物RNA反转录纯化试剂盒）和TransStart Green qPCR SuperMix（北京全式金荧光定量试剂），GB 4789.35—2010乳酸菌检验中所述试剂。

仪器：Eppendorf 5810高速冷冻离心机，ND-100微量紫外分光光度计，AB-Veriti PCR仪，ABStepOne荧光定量PCR仪，GB 4789.35—2010乳酸菌检验中所述仪器。

1.2 试验方法

1.2.1 样品采集

取连续生产3批产品，随机抽取3瓶样品进行试验。

1.2.2 荧光定量PCR法

（1）RNA的提取及纯化。将供试样品摇匀后吸取1 mL液体移入离心管中离心收集菌体。之后按照Trizol试剂盒说明书提取样品RNA，检测RNA纯度和浓度后，应用TaKaRa试剂盒于42℃水浴锅中恒温处理2 min去除基因组DNA，最后将纯化的RNA贮存于-70℃备用。

（2）RNA的反转录。以提取纯化的总RNA为模板，使用TaKaRa反转录试剂盒，将混匀的反应液放置在PCR仪中37℃保温15 min而后85℃加热7 s最后将反转录成的cDNA降温至4℃保藏。

（3）特异性引物的筛选。以L.casei Zhang全基因组序列为依据，选取其中一段特异性片段设计引物，应用该引物扩增Lactobacillus casei参考菌株，特异性引物信息见图1。参照以往试验及文献[12]，设计双歧杆菌属的特异性引物，引物序列为Bifid-F CTCCTGGAAACGGGTGG；Bifid-RGGTGTTCTTCCCGATATCTACA。

（4）标准品的制备和标准曲线的绘制。标准品的制备：提取L.casei Zhang和B.lactis V9的宏基因组DNA，应用微量紫外分光光度计测定浓度，根据已知L.casei Zhang和B.lactis V9的基因组片段长度，依据拷贝数计算公式计算出单位浓度的基因组DNA中所包含的L.casei Zhang和B.lactis V9的个数，将此单位浓度的基因组DNA进行10倍系列稀释并以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应。标准曲线的绘制：以含有梯度稀释个数的L.casei Zhang和B.lactis V9宏基因组DNA阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标扩增得到L.casei Zhang和B.lactis V9的定量扩增标准曲线，以此作为待测样品中L.casei Zhang和B.lactis V9数量测定的参照标准。

（5）活菌数的测定。以待测样品反转录的cDNA和标准品为模板，用L.casei Zhang和B.lactis V9特异性引物进行荧光定量PCR扩增。反应参数为：95℃（20 s）；40个循环，95℃（5 s），65℃（30 s），72℃（40 s）。 将扩增结果和标准曲线比对计算出每毫升样品中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌数。

1.2.3 平板菌落计数方法

具体方法见GB 4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验。

1.2.4 数据统计分析

3个平行试验数据采用SAS ANOVA程序处理，P＜0.05。

2 试验结果

2.1 荧光定量PCR法测定

2.1.1 样品中RNA提取

从“百益多”中提取的RNA经电泳检测后如图2所示，从图中可以看出总RNA 3条带清楚分明，亮度较强，纯度较高。完全满足后续试验需求。

2.1.2 L.casei Zhang和B.lactis V9荧光定量扩增标准曲线

以梯度稀释的标准品为模板进行荧光定量PCR，绘制的L.casei Zhang和B.lactis V9荧光定量扩增标准曲线，曲线方程分别为：Y=-2.914x+40.211（R2=0.998） 和Y=-3.461x+47.627（R2=0.999）。该标准曲线R值分别为0.998和0.999，精确度较高，因此该标准曲线可以作为待测样品中L.casei Zhang和B.lactis V9数量测定的参考依据。

2.1.3 L.casei Zhang和B.lactis V9活菌数检测

以每毫升“百益多”中反转录的cDNA为模板，进行荧光定量PCR，将荧光定量的结果和L.casei Zhang及B.lactis V9扩增标准曲线进行比对后计算出每毫升“百益多”中所含有的L.casei Zhang和B.lactis V9活菌数，结果见表1。结果测得L.casei Zhang活菌数为（1.2±0.07）×109mL-1，B.lactis V9活菌数为（1.5±0.10）×109mL-1。

2.2 平板菌落计数法测定

采用平板菌落计数法测得2株益生菌活菌数见表1。3个平行样品，选取适宜稀释梯度，每个梯度涂布2个平板，结果取平均值，测得样品中L.casei Zhang活菌数为（9.1±0.17）×108mL-1，B.lactis V9活菌数为（6.5±0.09）×108mL-1。

表1 百益多饮料中L.casei Zhang和B.lactis V9活菌数测定结果CFU·mL-1

3 讨 论

本研究中采用荧光定量PCR法，对活性益生菌豆乳饮料“百益多”中2株益生菌L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌数进行了检测，同时以平板菌落计数方法进行了对比检测。荧光定量PCR法测得L.casei Zhang活菌数为 （1.2±0.07）×109mL-1，B.lactis V9活菌数为（1.5±0.10）×109mL-1， 平板菌落计数法测得活菌数分别为（9.1±0.17）×108mL-1和（6.5±0.09）×108mL-1。 两种方法检测的L.casei Zhang活菌数差异不显著 （P＜0.05），但是采用荧光定量PCR法测得的B.lactis V9活菌数显著高于平板计数法（P＜0.05）。双歧杆菌为专性厌氧菌，操作过程中，环境中的氧气可能会导致部分双歧杆菌死亡，进而影响活菌数的准确性[1]，另外，平板菌落计数是以选择性培养基为基础的，选择性培养基成分较复杂，常以一定浓度抗生素来选择计数目标菌[13-14]。本文采用荧光定量PCR法计数B.lactis V9，其活菌数是平板菌落计数法（MRS固体培养基中添加一定浓度的抗生素莫匹罗星）的2.3倍。

益生菌活菌数的准确数量受其所在载体、其自身活力、应激状态及所在产品生产条件等因素影响。应激状态下的菌体细胞，在液体培养基中较固体培养基中生长良好[15]，这可能是本研究中平板计数法活菌数较低的原因之一。研究表明，双歧杆菌在乳制品生产发酵过程中会聚集形成菌团，采用平板菌落计数法对此发酵产物中双歧杆菌进行计数时，此菌团在固体培养基上形成单个菌落，而不是单个细胞形成的菌落，由此造成实际数量偏低[15]，这也可能是本研究中平板计数法活菌数较低的另一原因。另外，本研究所用抗生素选择计数目标菌B.lactis V9，菌体活力及数量对抗生素浓度的敏感程度不同，可能对活菌数造成一定影响。

通过提取RNA再发转录为cDNA，然后用荧光定量PCR检测样品中活菌数，此方法已应用于发酵乳制品和益生菌制品中乳酸菌的定量检测，大量研究结果表明此方法检测乳酸杆菌，快速、灵敏而且特异性较高[16-17]。因此，采用荧光定量PCR法计数更能真实的反应“百益多”中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌数。

4 结 论

本文以平板菌落计数法为对照，通过荧光定量PCR法，检测活性益生菌豆乳饮料“百益多”中2株益生菌L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌数。结果表明荧光定量PCR法操作简单，检测时间短，检测结果可靠性好，稳定性高，可真实反应检测样品中L.casei Zhang和B.lactis V9的活菌数。

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Lactobacillus casei Zhang Bifidobacterium lactis V9 Method of fluorescent quantitative PCR for detection of Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium lactis V9

Qimugesudu1,WANG Ji-cheng2,ZHANG Jia-chao2,ZHANG He-ping2
（1.Qingdao Junyi Food Co.Ltd.,Qingdao 266107,China 2.Key Lab of Dairy Biotechnology and Bioengineer of Education Ministry of China,Inner Mongolia Agricultural University,Huhhot 010018,China）

The viable count of probiotic is considered as the most important index and the accurate and scientific assay of probiotic viable number is essential to probiotic products.In the present study,the fluorescent quantitative PCR method and plate colony counting method were used and compared for detection of bacterial viable numbers of Lactobacillus casei Zhang and Bifidobacterium lactis V9 in probiotic fermented beverage.The result showed that there was no significant difference of L.casei Zhang number between two methods,whereas the numbers of B.lactis V9 detected by two methods were significant difference.It is suggested that fluorescent quantitative PCR method appear to be highly accurate,specific,fast and reliable for quantification of L.casei Zhang and B.lactis V9.

Fluorescent quantitative PCR;colony counting;Lactobacillus casei Zhang;Bifidobacterium lactis V9

TS252.7

A

1001-2230（2011）12-0031-03

2011-10-08

国家高技术研究发展计划（863项目，2011AA100901，

2011AA100902）。

其木格苏都（1983-）女,工程师,从事乳制品科学方面的研究。

张和平