酪蛋白类蛋白物的溶剂分级和酶水解对ACE抑制活性的影响

孙辉，赵新淮

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

酪蛋白类蛋白物的溶剂分级和酶水解对ACE抑制活性的影响

孙辉，赵新淮

（东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室，哈尔滨 150030）

利用响应面法优化类蛋白反应条件修饰酪蛋白水解物制备酪蛋白类蛋白物。酪蛋白类蛋白物的ACE抑制活性高于酪蛋白水解物，IC50值从52.6 mg/L降低到14.9 mg/L。利用乙醇-水混合溶剂对酪蛋白水解物和类蛋白物进行分级，结果表明，极性最低的溶剂得到的上清液部分活性较高，而沉淀部分活性较低。4种蛋白酶水解酪蛋白类蛋白物的分级产物，导致活性下降，除碱性蛋白酶外，木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解产物ACE抑制活性为31.5%～46.8%，但是仍然高于酪蛋白水解物的ACE抑制活性（27.8%），表明类蛋白反应提高了酪蛋白水解物对一些蛋白酶的体外抵抗能力。

酪蛋白水解物；类蛋白反应；碱性蛋白酶；乙醇分级；ACE抑制活性

0 引 言

Oshima等[1]从蛋白凝胶水解物中分离出6个ACE抑制肽之后，大量的ACE抑制肽从不同食品蛋白质的酶解产物中分离，包括：大豆蛋白、玉米蛋白、菜籽蛋白、乳蛋白、鱼肉蛋白、米糟和酒糟蛋白、鸡蛋蛋白、虾蛋白以及其他蛋白质[2-12]。

类蛋白反应在化学机制上涉及肽分子的缩合作用[13]、转肽作用[14]。利用类蛋白反应修饰活性肽，将导致某些肽分子的结构改变（即产生新的序列）和活性变化。碱性蛋白酶催化下，酪蛋白水解物的类蛋白反应修饰可以提高其体外ACE抑制活性[15-16]。因此，本研究在此基础上，利用乙醇-水溶剂体系处理修饰产物，得到2个分级产物（上清液部分和沉淀部分），然后研究分级产物的ACE抑制活性以及体外酶水解对活性的影响作用。

1 实 验

1.1 材料

酪蛋白（蛋白质质量分数86.1%），碱性蛋白酶，胰蛋白酶，胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，兔肺丙酮粉和FAPGG（FA-Phe-Gly-Gly），其他所有试剂均为分析纯。

1.2 设备

UV-2401PC型紫外可见分光光度计，AL204型分析天平，LGJ-1型真空冷冻干燥机，HZQ-F160型全温振荡培养箱，DELTA 320型精密pH计，G1-21M离心机，H-1型微型漩涡混合器，YH-4BS型远红外恒温干燥箱，DK-98-1型电热恒温水浴锅。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白水解物的制备

配制质量浓度为100 g/L的酪蛋白溶液，用浓度为2 mol/L的NaOH调节pH值至8.0，加入碱性蛋白酶（1 kU/g），55℃下分别水解1，2，3，4，5，6，7，8 h；取出20 mL样品溶液，迅速置沸水浴中灭酶，冷却后2 800 g离心20 min，分离出上清液，测定上清液中蛋白质和游离氨基量，计算其水解度；同时测定上清液的ACE抑制活性和IC50。根据ACE抑制活性大小确定酪蛋白水解物的制备条件，放大试验，制备的上清液（酪蛋白水解物）真空冷冻干燥后于-20℃保藏。

1.3.2 酪蛋白水解物的类蛋白反应修饰

用碱性蛋白酶对酪蛋白水解产物进行类蛋白反应修饰。反应结束后，修饰产物（类蛋白物）在沸水浴灭酶15 min，冷却后测定游离氨基量。

采用中心组合实验，通过测定反应体系的游离氨基量减少量变化（底物游离氨基含量减去修饰产物游离氨基量），响应面法优化酶添加量、底物浓度、温度等3个反应条件，然后分析类蛋白物的ACE抑制活性和IC50。

1.3.3 乙醇-水溶剂的分级处理

将具有最高ACE抑制活性的酪蛋白水解物和类蛋白物，分别加入到3个乙醇-水混合溶剂（体积比分别为3∶7，5∶5，7∶3）中，使其质量浓度达到500 g/L。 混匀后于9 000 g条件下离心30 min，分离出上清液和沉淀部分（分级产物），并分别测定肽收率、游离氨基量和ACE抑制活性。根据ACE抑制活性大小，确定溶剂的组成，放大试验，将上清液和沉淀部分分别冻干。

1.3.4 分级产物的进一步酶水解

配置质量浓度为100 g/L的分级产物水溶液，分别加入蛋白酶进行水解，所选择的条件为：碱性蛋白酶，pH值为8.0，温度55℃，酶添加量1 000 U/g；胰蛋白酶，pH值为8.1，温度37℃，酶添加量2 000 U/g；中性蛋白酶，pH值为7.0，温度40℃，酶添加量1 000 U/g；木瓜蛋白酶，pH值为6.5，温度45℃，酶添加量2 000 U/g。在反应进行10 min和30 min时，迅速加热至95℃灭酶终止反应，得到的酶解产物进行相关分析。

1.3.5 有关分析和测定

1.3.5.1 蛋白质质量分数、水解度及蛋白酶活力的测定

（1）蛋白质质量分数测定采用凯氏定氮法[17]。

（2）游离氨基量及酪蛋白水解度（DH）测定采用邻苯二甲醛（OPA）法[18-19]。

OPA试剂：称取2.00 g十二烷基磺酸钠（SDS），加入30 mL浓度为0.4 mol/L的硼酸缓冲溶液 （pH 9.5），水浴加热使其完全溶解，冷却至室温后再加入1 mL质量浓度为80 g/L的OPA乙醇溶液和200 μL β-巯基乙醇，硼酸缓冲溶液定容至100 mL，此溶液要现用现配。

游离氨基量测定：配制不同浓度的亮氨酸标准溶液（0～30 mg/L），取3 mL标准溶液与同体积的OPA试剂混合并开始计时，5 min后在分光光度计上340 nm波长下测定。以吸光值为横坐标、亮氨酸质量浓度为纵坐标绘制标准曲线。按照标准曲线制作步骤，测定样品的吸光值，并根据标准曲线回归方程计算其游离氨基量。

水解度计算公式[20]如下：

其中0.6 mmol/g为实际测定出的酪蛋白的游离氨基量。

（3）蛋白酶活力测定：采用福林酚法、以酪蛋白为底物测定[21]。

1.3.5.2 ACE抑制活性的测定

以FAPGG为底物，采用非连续分光光度法测定样品的ACE抑制活性[22-23]。

ACE酶液：称取50 mg兔肺丙酮粉浸泡于5 mL预冷至4℃的硼酸缓冲溶液（pH值为8.3，浓度100 mmol/L）中，放入4℃恒温震荡摇床中提取12 h，45 000 g冷冻离心20 min，上清液于4℃低温保存。

FAPGG底物溶液：将FAPGG溶于浓度为100mmol/L的硼酸缓冲溶液 （pH值为8.3，浓度为300 mmol/L的NaCl），配制浓度为1.6 mmol/L的溶液。

ACE抑制活性测定：500 μL FAPGG底物溶液与100 μL超纯水或ACE抑制肽溶液混匀，37℃预热2 min，加300 μL ACE酶液并在37℃反应30 min，立即加100 μL EDTA（浓度为100 mmol/L）终止反应；加3 000 μL超纯水稀释，平行3次。0 min样品的测定时先加入EDTA再加入ACE酶液，其他相同。分光光度计上340 nm下分别测体系在0 min和30 min时的吸光值，计算差值△A（△A=A0min–A30min）。以单位时间内吸光值变化表示ACE酶活力，对ACE的抑制活性按下式计算：

式中：△Ac，加入超纯水时吸光值在30 min内的变化；△Ai，为加入抑制剂时吸光值在30 min内的变化。

IC50计算：IC50定义为抑制50%ACE酶活力时抑制剂的浓度；配置不同浓度或质量浓度的ACE抑制剂，按以上步骤测定其ACE抑制活性。以抑制剂质量浓度的对数为横坐标、ACE抑制活性为纵坐标，进行回归分析，利用回归方程计算抑制剂的半抑制浓度（IC50）。

2 结果与讨论

2.1 酪蛋白水解物的制备

蛋白质本身的ACE抑制活性很低，甚至不具有活性，但通过体内或体外蛋白酶水解，释放出来的肽即可在体内外发挥ACE抑制活性。碱性蛋白酶属于内切酶， 对由Phe，Trp，Tyr，Glu，Met，Leu，Ala，Ser和Lys形成的肽键具有高度专一性[24]。选用碱性蛋白酶水解酪蛋白，可以获得较高活性的ACE抑制肽。试验结果表明，在所选择的条件下利用碱性蛋白酶水解酪蛋白时，酪蛋白水解物的ACE抑制活性先随水解时间增加而增加，后呈现降趋势；在水解时间为6 h时，酪蛋白水解物的ACE抑制活性最高 （27.8%），此时水解度为10.9%， 其 游 离 氨 基 量 为1 780.9 μmol/g，IC50为52.6 mg/L。所以，选择此酪蛋白水解物作为类蛋白修饰反应的底物。

2.2 酪蛋白水解物的类蛋白反应修饰与产物ACE抑制活性

固定反应时间为6 h，采用三因素五水平响应面方法（共20组实验，表1）分析，以反应体系游离氨基减少量为响应值，研究酶添加量、底物质量分数、反应温度对酪蛋白类蛋白反应修饰的影响。表1响应面分析的因素水平编码

根据试验结果（这里不再介绍），得到优化的修饰反应条件为：酶添加量3.1 kU/g，温度25℃，底物质量分数50%，反应时间6 h。最大响应值游离氨基量减少为116.97 μmol/g。验证试验3次，得到的游离氨基量减少为112.09 μmol/g（平行值），与理论值无显著差异，说明响应面法得到的条件参数可靠。酪蛋白水解产物修饰后，所得到的酪蛋白类蛋白物具有更高的ACE抑制活性（73.2%），分析结果表明其IC50降低至14.9 mg/L（低于酪蛋白水解物的52.6 mg/L）。所以，选择此类蛋白物作为溶剂分级的底物。

2.3 乙醇-水溶剂分级处理与分级产物的ACE抑制活性

用3个乙醇-水混合溶剂 （乙醇和水体积比分别为3∶7，5∶5，7∶3）对酪蛋白水解物进行分级，得到相应的上清液部分和沉淀部分。分析结果表明这两部分组成、ACE抑制活性存在不同，与所使用的分级溶剂的组成有关，如表2所示。上清液部分的回收率随分级溶剂中乙醇体积分数的增加而减少，而沉淀部分则相反；由于有少量损失，二者之和不足100%。重要的是，上清液部分的ACE抑制活性均高于酪蛋白水解物，而沉淀部分活性均低于酪蛋白水解物，且用7∶3（体积比）乙醇-水溶剂分级处理时所得到的上清液部分活性最高（34.0%）。这表明：低极性的乙醇-水溶剂体系可以用于分离出更高ACE抑制活性的蛋白质水解物。

同样，用这3个乙醇-水溶剂对酪蛋白类蛋白物进行分级处理，结果如表3所示。分析结果显示，上清液、沉淀部分的回收率、游离氨基量、ACE抑制活性变化，与酪蛋白水解物的分级产物的变化规律基本一致。用7∶3（体积比）乙醇-水溶剂分级时，得到的上清液部分活性最高（78.8%），IC50降低至11.8 mg/L。

表2 酪蛋白水解物的乙醇-水溶剂分级与分级产物的ACE抑制活性

表3 酪蛋白类蛋白物的乙醇-水溶剂分级与分级产物的ACE抑制活性

Pan等研究指出，ACE抑制肽富含疏水性氨基酸和芳香族氨基酸[25]。乙醇极性低，水的极性较高。所选择的3个溶剂中，7∶3（体积比）的乙醇-水溶剂具有最高的乙醇体积分数和最低的极性。所以，这个溶剂可以富集低极性（含较多的疏水性氨基酸）的肽组分，而沉淀则富集高极性（含较多亲水性氨基酸）的肽组分。这样就导致上清液部分具有较高的ACE抑制活性，而沉淀部分的ACE抑制活性相应降低。

2.4 分级产物进一步酶解与ACE抑制活性变化

对酪蛋白类蛋白物的乙醇-水溶剂（7∶3，体积比）分级产物进一步酶水解，分别测定水解产物的的游离氨基增加量和ACE抑制活性，表4给出分析结果。可以看出：（1）碱性蛋白酶对分级产物有较强的水解作用（游离氨基增加量较大），胰蛋白酶则刚好相反；（2）所有的水解产物的ACE抑制活性从19.2%到46.8%，均低于酪蛋白类蛋白物（73.2%）和分级产物（上清液部分78.8%，沉淀部分65.6%），表明分级产物的进一步水解会破坏类蛋白物的ACE抑制活性，且降低程度与水解酶（例如碱性蛋白酶）和水解时间（例如30 min）密切相关；（3）整体上看，碱性蛋白酶对分级产物的ACE抑制活性破坏最大，其他3种蛋白酶的破坏作用相对较小；（4）即使水解30 min，其他3种蛋白酶水解产物的ACE抑制活性为31.5%到46.8%，高于酪蛋白水解物的活性（27.8%）。通过以上分析可以看出，类蛋白反应能够提高酪蛋白水解物的ACE抑制活性，同时还使得它（或者说分级产物）对一些蛋白酶具有一定的抵抗能力，即提高了其稳定性。

表4 酶水解对酪蛋白类蛋白物分级产物ACE抑制活性的影响

3 结 论

（1）利用碱性蛋白酶对酪蛋白进行水解和分离，在水解时间为6 h时制备出水解度为10.9%的酪蛋白水解物，其ACE抑制活性最高27.8%，IC50质量浓度为52.6 mg/L，游离氨基量为1780.9 μmol/g。

（2）利用碱性蛋白酶对酪蛋白水解物进行修饰时，以游离氨基含量减少量为指标，响应面法优化得到的反应条件为：酶添加量3.1 kU/g，底物质量分数50%，反应温度25℃，反应时间6 h。制备的酪蛋白类蛋白物游离氨基量为1668.8 μmol/g，IC50降低至14.9 mg/L。

（3）对酪蛋白水解物进行乙醇-水溶剂分级处理。结果表明，7∶3（体积比）乙醇-水分级得到的上清液部分ACE抑制活性明显高于酪蛋白水解物，沉淀部分的ACE抑制活性则低于酪蛋白水解物。对酪蛋白类蛋白物同样进行乙醇-水溶剂分级处理，产生相似的结果。低极性溶剂富集疏水性肽组分，是分级产物上清液部分ACE抑制活性显著提高的主要原因。

（4）酪蛋白类蛋白物分级产物的进一步酶水解，会降低其ACE抑制活性。分级产物对碱性蛋白酶的抗拒能力较弱，对胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶的抗拒能力相对较强。水解后的分级产物其ACE抑制活性大多高于酪蛋白水解物，表明类蛋白反应提高了酪蛋白ACE抑制肽的活性与稳定性。

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Impact of solvent fractionation and enzymatic hydrolysis of casein hydrolysate modified by plastein reaction on its ACE inhibition

SUN Hui,ZHAO Xin-huai
（Northeast Agricultural University Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Harbin 150030,China）

The prepared hydrolysate was modified by the plastein reaction under the response-surface-methodology optimized conditions to prepare casein plasteins.The casein plasteins exhibited a higher ACE-inhibitory activity in vitro than the original hydrolysate as its value of IC50 was decreased from original 52.6 to 14.9 μg/mL.When the original hydrolysate or the plasteins was fractionated by ethanol-water solvents respectively,the soluble fractions obtained by the solvent of the lowest polarity had a higher activity but the precipitate fractions a lower one.Further enzymatic hydrolysis of the fractionated products of the plasteins by four proteases would damage their activities.The analysis results showed that the final hydrolyzed products of the plasteins by papain,pepsin or trypsin except for alcalase had a residue activity about 31.5%～46.8%,higher than the original hydrolysate（27.8%）.It was revealed that the carried out plastein reaction enhanced the resistance of casein hydrolysate to some proteases in vitro.

casein hydrolysate;plastein reaction;alcalase;ethanol fractionation;ACE-inhibitory activity

Q591.2

A

1001-2230（2011）12-0004-04

2011-09-26

黑龙江省高等学校科技创新团队建设计划项目（2010td11）。

孙辉（1986-），女，硕士研究生，研究方向为食品科学。

赵新淮