嗜酸乳杆菌的表面疏水性分析

赵维俊，吕嘉枥，马强，李瑛

（陕西科技大学 生命科学与工程学院，西安 710021）

嗜酸乳杆菌的表面疏水性分析

赵维俊，吕嘉枥，马强，李瑛

（陕西科技大学 生命科学与工程学院，西安 710021）

对嗜酸乳杆菌的表面疏水性进行分析。利用微生物粘着碳氢化合物法测定嗜酸乳杆菌的表面疏水率，通过采用不同环境条件和胰蛋白酶处理菌体细胞表面，初步确定嗜酸乳杆菌表面疏水性的影响因素。结果表明，影响菌体表面疏水性的因素有时间、温度、pH值、浓度、Ca2+和胰蛋白酶，菌体表面疏水性具有时间、温度、pH值和浓度依赖性，Ca2+和胰蛋白酶对其有一定作用，且表面疏水性与黏附能力之间存在着相关性；此外，推测能够介导嗜酸乳杆菌表面疏水性的某些物质可能是一类蛋白质。

嗜酸乳杆菌；疏水性；黏附；影响因素

0 引 言

嗜酸乳杆菌具有促进肠道内微生物菌群的生态平衡，改善肠道菌群结构、促进肠道中有益菌的增殖、抑制有害菌的生长、增强机体免疫力和缓解乳糖不耐症等重要生理功效，对于高血压、高血脂、心脏病、糖尿病和癌症的防治有着重要意义[1-3]。嗜酸乳杆菌通过黏附于肠上皮细胞表面，定植形成稳定的菌群发挥作用。因此，黏附是嗜酸乳杆菌发挥生物屏障功能的基础。经国内外研究表明，细菌表面疏水性的强弱与细菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸和荚膜等附着器有关，并且主要取决于其表面的某些物理化学特性[4]，被认为与细菌的特异性黏附相关。但是，现如今关于疏水性与黏附性关系的研究较少。

本研究以嗜酸乳杆菌为研究对象，通过体外测定其表面疏水率来分析表面疏水性的影响因素及其与黏附性的关系；通过研究不同处理条件对受试菌株疏水率的影响，初步确定嗜酸乳杆菌菌体表面疏水性表达所依赖的环境条件和物质条件，以及其表面疏水性与黏附性的相关性。

1 试 验

1.1 材料

供试菌株为嗜酸乳杆菌 （Lactobacillus acidophilus）AS1.1854。

培养基和化学试剂：MRS肉汤培养基（均为质量浓度）：酪胨10.0 g/L，牛肉粉8.0 g/L，酵母粉4.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，硫酸镁0.2 g/L，乙酸钠5.0 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L，磷酸氢二钾2.0 g/L，硫酸锰0.05 g/L，吐温-80 1.0 g/L，pH值为6.2±0.2；胰蛋白酶（Trypsin 1：250）；十六烷（Hexadecane）；其他试剂均为国产分析纯。

仪器与设备：紫外分光光度计UV-2600型；高速冷冻离心机（HC-3018型）；数码显微镜；隔水式恒温培养箱GNP-9160型。

1.2 细菌的培养和保存

嗜酸乳杆菌以体积分数为1%接种量接种于MRS肉汤培养基，37℃厌氧培养10 h。菌种均在体积分数为30%甘油中于-80℃下冻存。

1.3 菌株表面疏水率的测定

通过试验菌株对碳氢化合物的亲和力反映菌株表面疏水性，采用微生物粘着碳氢化合物法（Bacteria Adhesion To Hydrocarbons,BATH）[2]，并略加修改，测定嗜酸乳杆菌细胞表面疏水性。将细菌培养物以6 000 r/min，4℃，离心10 min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液（浓度为0.2 mol/L的Na2HPO4·12H2O 18.5 mL+0.2 mol/L的NaH2PO4·2H2O 81.5 mL， 稀释1倍，pH=6.2）洗涤菌体2次，10 mL/次[5]。将菌体以磷酸盐缓冲液为空白对照，用磷酸盐缓冲液调整菌液浓度，使其在分光光度计600 nm波长下OD值为0.6±0.02。取4 mL调整浓度后的菌液分别加入200 μL十六烷和二甲苯，对照组不加，该两相体系通过涡旋彻底混合60 s，静置15 min分层。取水相，以磷酸盐缓冲液为空白对照，测量A600值，记录。每组平行做10管，分别记录OD值。进行5次独立的实验。

1.4 观察指标和方法

（1）生长阶段对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响。按体积分数为1%的比例接种嗜酸乳杆菌菌液于MRS肉 汤 培 养 基 ，37℃ 厌 氧 培 养4，6，8，10，12，14，16，18，24 h后，离心收集细菌，用磷酸盐缓冲液洗涤后重新悬浮，在紫外可见分光光度仪上测定600 nm处的吸光度值，以培养时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制生长曲线。 分别取经4，6，8，10，12，14，16，18，24 h培养的嗜酸乳杆菌培养物，进行疏水率试验。并在上图基础上以疏水率为次纵坐标作图。

（2）不同培养温度对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响。 分别将嗜酸乳杆菌置于28，32，37，41，45℃条件下培养10 h后，进行疏水率试验。

（3）不同试验温度对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响。 试验分别置于20，28，37，41，45，50，55℃条件下进行。

（4）pH值对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响。用浓度为1 mol/L盐酸调节磷酸盐缓冲液的pH值为7.0，6.0，5.5，5.0，4.5，4.0，3.0；分别悬浮菌体，进行疏水率试验。

（5）菌悬液浓度对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响。取嗜酸乳杆菌培养物，用磷酸盐缓冲液调整菌浓度（OD）分别 为0.2，0.3，0.5，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4；采用BATH法测定疏水率的浓度依赖曲线，以所加嗜酸乳杆菌的浓度为横坐标，疏水率为纵坐标作图。

（6）不同Ca2+浓度对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响[6]。 用0～8 mmol/L不同浓度的CaCl2水溶液，37℃处理菌体，30min，磷酸盐缓冲液洗涤后，进行疏水率试验。

（7）胰蛋白酶对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响：用0.0025～2.5 mg/mL不同浓度的胰蛋白酶，37℃处理菌体，30 min，磷酸盐缓冲液洗涤后，进行疏水率试验。

1.5 菌株表面疏水率的计算及统计学处理

用单因素方差分析比较各组总体均数间差别，用t检验方法进行组间样本均数的两两比较，用平均值±标准偏差确定疏水率参考值范围。菌株表面疏水率为

疏水率 （%）=（对照组A600-实验组A600）/对照组A600×100。

2 结果和分析

2.1 生长阶段对疏水率的影响

通过对嗜酸乳杆菌在培养24 h内的发酵液OD和pH值及菌体表面疏水率的测定，结果如图1所示。由图1可以看出，在0～4 h培养时间内发酵液OD值和pH值变化较小，4～8 h发酵液OD呈稳步增长趋势，平均高达1.60，发酵液pH值持续下降至4.42，8～14 h内变化趋势明显变小，而在14 h后发酵液OD和pH值基本分别保持在2.00和4.10左右。另外，菌体表面疏水率在培养8 h后出现最高值，以后随着培养时间的增加菌体表面疏水率显著降低。

2.2 不同温度对表面疏水率的影响

在不同培养温度条件下，嗜酸乳杆菌经10 h培养后，发酵液OD和pH值的变化如图2所示。由图2可以看出，发酵液OD和pH值在37～41℃培养条件下分别达到最大值1.92和最小值4.14，并且分别以十六烷和二甲苯作为吸附剂，菌体表面疏水率也具有显著差异性，其中培养温度为37～41℃时菌体表面疏水率最高。

在不同试验温度条件下，嗜酸乳杆菌表面疏水率也会随试验温度的变化而变化（如图3所示），彼此存在显著性差异（P＜0.01）。当试验温度为41～45℃时，菌体呈现最高疏水率。

2.3 pH值对表面疏水率的影响

图4为pH值对嗜酸乳杆菌表面疏水率的影响。由图4可以看出，嗜酸乳杆菌表面疏水率受pH值的影响较大，当缓冲液pH值为4.0～4.5时，菌体表面疏水率均高于其他试验组。当缓冲液pH值为7.0时，菌体表面疏水率显著低于酸性缓冲液试验组（P＜0.01）。

2.4 菌悬液浓度对表面疏水率的影响

在不同菌悬液浓度下嗜酸乳杆菌的表面疏水性如图5所示。由图5可以看出，嗜酸乳杆菌在浓度（OD）为0.2时，表面疏水率最高；但是菌悬液浓度变化量以浓度（OD）为0.5～0.6时最大，且此时表面疏水率与低浓度时相比没有显著性变化。而当浓度逐渐增大时，菌体表面疏水率也随之发生极显著的降低，浓度（OD）增至1.4时的表面疏水率降到最低值（P＜0.01）。

2.5 Ca2+和胰蛋白酶对表面疏水率的影响

嗜酸乳杆菌经不同浓度的Ca2+处理后，表面疏水性受到一定影响，结果如图6所示。由图6可以看出，随着Ca2+浓度的增加，其表面疏水率也发生显著的增高（P＜0.01）。当Ca2+浓度达到5 mmol/L时，表面疏水率最高。若再提高Ca2+浓度，则其表面疏水率不发生显著变化。

胰蛋白酶对嗜酸乳杆菌表面疏水性的影响如图7所示。由图7可以看出，与未经处理的菌体细胞相比，经胰蛋白酶作用后的菌体细胞，表面疏水率发生极显著的降低（P＜0.01）。当胰蛋白酶质量浓度达1.5 mg/L时，菌体的表面疏水性完全消失。

3 讨 论

经国内外研究表明，细菌表面疏水性的强弱与细菌表面蛋白、菌毛、脂磷壁酸、荚膜等附着器有关，被认为与细菌的特异性黏附相关。因此，嗜酸乳杆菌的表面疏水性可能与其黏附性存在一定相关性。为了更好的研究嗜酸乳杆菌表面疏水性与黏附性的关系，我们利用BATH法研究了影响其表面疏水性的因素[7]。

从嗜酸乳杆菌的生长曲线（图1）可以看出，嗜酸乳杆菌在0～4 h培养时间内为菌体调整期，4～8 h为菌体对数生长期，8～18 h菌体稳定生长，代谢产物量增大，18 h后菌体代谢减弱，开始大量衰亡。选取不同生长时间点的嗜酸乳杆菌进行疏水性试验，结果随着细菌生长时间的延长，疏水率逐渐增加，但菌体进入稳定期时，表面疏水率与其他阶段差异具有显著性；菌体进入衰亡期后，表面疏水率发生显著降低。即嗜酸乳杆菌的表面疏水性具有时间依赖性。这表明菌体生长过程中，代谢产物可能参与调节自身的疏水作用。在稳定生长期，代谢旺盛，相关产物量较大，故而提高其表面疏水率，当进入生长后期时，由于代谢减慢，表面疏水率可能因缺少某些代谢物的调节而逐渐降低。

通过研究嗜酸乳杆菌培养温度、试验温度、pH值及菌液浓度对表面疏水性的影响时，发现嗜酸乳杆菌的表面疏水性具有温度、pH值及菌体浓度依赖性。菌体在37～41℃培养条件及41～45℃试验条件下有利于疏水性的表达；当菌体处于酸性（pH值为4.0～4.5）环境中，有较强的表面疏水性；当菌体浓度（OD）为0.2时，菌体表面疏水率较高，菌体浓度（OD）为0.5～0.6时次之，但菌体吸附于等量有机相（十六烷和二甲苯）中的量相对于浓度（OD）为0.5～0.6时较低，这可能与有机相的吸附饱和度有关。此结果与双歧杆菌黏附实验的结果相似[8]。许多报道指出，乳酸菌的黏附还具有离子依赖性，本文研究了Ca2+对嗜酸乳杆菌表面疏水性的影响，发现Ca2+浓度在一定范围内可提高菌体的表面疏水性。

为了进一步分析嗜酸乳杆菌表面疏水性与黏附性的相关性，根据已报道的乳杆菌黏附素组成（大多数为蛋白类物质）[9，10]，我们选用胰蛋白酶对该菌体细胞进行处理，所获得结果与乳杆菌LGG的黏附特性相似[11]，胰蛋白酶处理能显著降低嗜酸乳杆菌的表面疏水性，当胰蛋白酶达一定质量浓度（1.5 mg/L）时，菌体表面疏水性基本丧失。这说明了蛋白类物质在该菌的表面疏水性和黏附性表达过程中均起了重要的作用。

4 结 论

通过对嗜酸乳杆菌表面疏水性的分析，并参考大量报道资料，确定其表面疏水性与黏附能力之间存在着相关性，影响菌体表面疏水性的时间、温度、pH值、浓度、离子和酶等因素，同样也影响菌体黏附能力，表面疏水性高的菌株一般具有较高的黏附能力；此外，通过观察Ca2+离子及酶类处理后嗜酸乳杆菌表面疏水性的变化，推测出：Ca2+可能作为信号传递物质，促进菌体自身物质代谢，提高表面疏水性的表达，以及能够介导嗜酸乳杆菌表面疏水性的物质可能是一类蛋白质。但是具体的作用机制尚不清楚，在今后的研究中，将对菌体细胞代谢及相关蛋白进行进一步分析，从而为揭示乳酸菌黏附机制提供更多的依据。

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Analysis of the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus

ZHAO Wei-jun,LV Jia-li,MA Qiang,LI Ying
（College of Life Science and Engineering,Shannxi University of Science&Technology,Xi’an,710021,China）

We analyzed the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus.We utilized the method of microbial adhesion the hydrocarbons to determine the surface hydrophobic rate of Lactobacillus acidophilus and used the different environmental conditions and trypsin to process the cell to determine the influencing factors of the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus preliminary.Through this research,we obtained that the influencing factors of the surface hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus were time,temperature,pH,concentration,Ca2+and trypsin.Cell surface hydrophobicity had the dependent manner of time,temperature,pH and concentration,and was affected by the Ca2+and trypsin,and was connected with the adhesion ability.In addition,we speculated that some substances which could mediate the hydrophobicity of Lactobacillus acidophilus may be a class of proteins.

Lactobacillus acidophilus；hydrophobicity；adhesion；influencing factors

Q935

A

1001-2230（2011）10-0008-04

2011-06-28

陕西省“13115”项目（2009ZDKG-20）；陕西省教育厅项目（2010JK446）。

赵维俊（1986-），男，硕士研究生，研究方向为应用微生物学。

吕嘉枥