高效液相色谱法检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度

吴剑平，顾欣，李丹妮，严凤，张鑫

（1.上海市兽药饲料检测所，上海， 201103）

高效液相色谱法检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度

吴剑平，顾欣，李丹妮，严凤，张鑫

（1.上海市兽药饲料检测所，上海， 201103）

根据反相离子对色谱法的原理，建立了检测牛奶中硫氰酸钠质量浓度的高效液相色谱方法。前处理使用乙睛沉淀蛋白，碱性氧化铝SPE柱除去部分水溶性维生素、氨基酸，离心脱脂。以磷酸三乙胺（pH=7.00）∶甲醇=95∶5作为流动相，用Agela-ASB C18反相色谱柱（250mm×4.6mm，5 μm），柱温30℃±2℃，流速0.8 mL/min，以二极管阵列紫外检测器分析样品，质量浓度范围在5～500 mg/L内线性较好，r＞0.9995。该方法可适用于生鲜乳和巴氏灭菌成品乳，检测限可达到0.2 mg/kg，定量凡围0.5～50 mg/kg，精确度＜10%，回收率＞90%。 范围0.5～50 mg/kg，精确度＜10%，回收率＞90%。

硫氰酸钠；高效液相色谱法；反相离子对色谱法

0 引 言

近几年，随着乳品行业的迅速发展，乳品的质量安全也越来越受重视。牛乳中因含有丰富的营养物质，为微生物提供了良好的生长环境，因此牛乳极易腐败变质，在牛乳中掺入硫氰酸钠后可有效的抑菌、保鲜及延长牛乳的保存期。但是，硫氰酸钠也是毒害品，过量摄入会对人体造成危害，在2008年12月，卫生部发布的《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单（第一批）》中明确规定硫氰酸钠属于违法添加物质，但至今尚未发布相应的检测方法标准。目前常见的对牛奶中硫氰酸盐的检测方法为离子色谱法，其具有灵敏度高，分离效果好的特点，但是其前处理方法复杂，回收率也受到影响。高效液相色谱法使用极为广泛，因此有必要对研究高效液相色谱法检测牛奶中的硫氰酸盐。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Waters高效液相色谱系统（2695-2998二极管阵列检测器，Empower色谱工作站）；电子天平（Mettler AE240，瑞士）；高速冷冻离心机 （Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；减压旋转蒸发仪（B-490，BUCHI）；十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱（Agela-ASBC18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；碱性氧化铝SPE固相萃取柱 （Agela-Cleanert,1 000 mg×6mL）； 硫氰酸钠（98.5%）；磷酸（分析纯）；三乙胺（分析纯）；乙睛（色谱纯）；甲醇（色谱纯）；正丙醇（分析纯）；去离子水（自制，电阻率＞10 MΩ·cm）。

1.2 方法

1.2.1 磷酸盐缓冲液与流动相溶液制备

量取磷酸2.00 mL置1 000 mL容量瓶中，加水定容至刻度，摇匀，倒入烧杯中，逐滴加入三乙胺调节pH值至7.00±0.02，制得磷酸盐缓冲溶液。取950 mL磷酸盐缓冲液与50 mL色谱级甲醇混合均匀后，作为流动相,抽滤后备用。

1.2.2 标准贮备溶液与标准工作溶液制备

取硫氰酸钠对照品2.50 g，置250 mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，得1 g/L标准贮备液。分别精密量取该标准贮备液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 mL置200 mL容量瓶中用1.2.1所制得磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即得5，10，25，50，100，250，500 mg/L标准工作溶液。

1.2.3 色谱条件

色谱柱：Agela-ASB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为磷酸盐缓冲液︰乙睛=95︰5；柱温为30℃；流速为0.8 mL/min；检测波长为218 nm；进样量10 μL。在上述色谱条件下，对空白、标准工作溶液和样品溶液进行系统适用性试验，典型色谱图如图1所示。结果表明，硫氰酸钠的理论塔板数7623，主峰与杂质峰的分离度大于2.0，拖尾因子1.25。根据3倍信噪比计算可得其检测限为1 mg/L，10倍信噪比计算可得其定量限为3.3 mg/L。

1.2.4 前处理方法

精密量取样品10.00 mL，置50 mL具塞离心管中，加入乙睛15 mL，密塞强烈振摇提取3 min后，至高速冷冻离心机中，4℃下8 000 r/min离心3 min，小心取出全部上层清液，过碱性氧化铝SPE柱，挤干，收集全部流出液于100 mL梨型瓶中，加入1 mL正丙醇，置60℃恒温水浴中减压旋转蒸发至干，精密加入1.00 mL磷酸盐缓冲液，振荡溶解后，取出置2 mL的TIP离心管中，14000 r/min离心3 min脱脂后取水层溶液过0.45 μm滤膜，待测。

2 结 果

2.1 系统适应性参数

在1.2.3色谱条件下，对空白溶液、标准工作溶液和样品溶液进行系统适用性实验，典型色谱图如图1所示。结果表明，硫氰酸钠的理论塔板数不低于5 000，主峰与杂质峰的分离度大于2.0，拖尾因子小于1.5。结果表明，该色谱条件适用于牛奶中的硫氰酸钠的含量测定，根据实验结果3倍信噪比计算可得其仪器检测限为1 mg/L，10倍信噪比计算可得其定量限为3.3 mg/L。

2.2 标准曲线的制作

分别精密量取该标准贮备液1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00，100.00 mL置200 mL容量瓶中 用1.2.1所制得磷酸盐缓冲液定容至刻度，摇匀，即得5，10，25，50，100，250，500 mg/L标准工作溶液序列。各取10 μL上机测定，按1.2.3的色谱条件操作，每个浓度分别反复进样6次，记录色谱峰面积均值，以标准曲线序列工作液质量浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，得标准工作曲线A=18915C–15581，R=0.9999，回归曲线如图2所示。 结果表明，该方法进样质量浓度在5～500 mg/L范围内线性良好。

2.3 回收率实验

取生鲜乳3批 （批号：A-沪浦20101110-11，B-沪金20101029-07，C-沪松20100719-02）， 巴氏灭菌乳（D-三岛鲜牛奶20101027，E-光明学生奶20101024）各取10.00 mL，分别添加5，10，20 μL质量浓度为1 g/L的标准贮备液，按1.2.4前处理方法进行预处理，按1.2.3的色谱条件进行检测，所得结果如表1所示。结果表明，该方法的准确度和精密度都符合要求。

2.4 稳定性实验

取批号沪浦20101110-11的生鲜乳按1.2.4中的前处理方法制得样品溶液。取该溶液于分别于室温下保存0，4，8，12，24 h后以1.2.3仪器方法进行测定，KSCN峰面积的RSD分别为0.95%。实验结果表明，样品溶液中硫氰酸钠在24 h内稳定。

3 讨 论

3.1 流动相的选择

由于硫氰酸钠在水中电离成硫氰酸根，硫氰酸根是带电的强极性物质，因此在一般反相色谱柱上很难保留，因此考虑使用离子对色谱法增强其保留性质。一般用于阳离子的离子对试剂是烷基磺酸类如己烷磺酸钠等；而用于阴离子的离子对试剂往往是烷基胺类，如三乙胺，氢氧化四丁基胺等。由于三乙胺同时也可消除色谱峰拖尾，所以本法选择磷酸－三乙胺组成的缓冲盐体系。由于在酸性环境下三乙胺很难与硫氰酸根形成离子对化合物，因此将pH值调节至7.00。同时也尝试了甲醇和乙睛作为有机相。如图3所示，结果表明，质量分数0.2%磷酸（三乙胺调节pH＝7.00）︰乙睛＝95︰5能取得较好的峰型和系统适应性参数。

表1 回收率测定结果（n=6）

图3（a）中，质量分数为0.2%磷酸（NaOH饱和溶液调pH＝7.00）︰乙睛＝90︰10；图3（b）中，质量分数为0.2%磷酸︰乙睛＝90︰10；图3（c）中，质量分数为0.2%磷酸︰甲醇＝90︰10；图3（d）中,质量分数0.2%磷酸︰甲醇＝95︰5。上述质量分数为0.2%的磷酸，三乙胺调pH值均为7.00。

3.2 净化方法的选择

牛奶中干扰硫氰酸钠检测的主要杂质为蛋白质、脂肪、氨基酸和水溶性维生素，因此净化方法考虑主要能除去这些干扰物质。通过加乙睛可以使牛奶中的大部分蛋白质变性，发生絮凝，然后通过高速冷冻离心机4℃下8 000 r/min离心3 min，使絮凝的蛋白质发生沉淀，同时也可使部分的脂肪层与水相分离，离心后的提取液中还含有大量氨基酸和水溶性维生素以及部分蛋白质，若直接进样检测杂峰干扰较严重，因此选择了不同的填料的固相萃取柱进行净化，尝试了酸性氧化铝，中性氧化铝，碱性氧化铝，氟洛里硅藻土4种填料对批号为20101024的学生奶进行净化后测定质量浓度，所得色谱图如图4所示，结果如表2所示。结果表明，碱性氧化铝柱和中性氧化铝柱都可以取得较好的回收率，但是从色谱图来看碱性氧化铝对牛奶提取液中的氨基酸和水溶性维生素的吸附效果更好，对硫氰酸盐的回收率影响也不大，可以应用在净化方法中。

表2 净化回收率测定比较结果表（n=3）

4 结 论

以上实验结果表明，该方法操作简便易行，色谱系统适用性良好，方法的准确性、重复性均较好，可用于生鲜乳和巴氏成品乳中硫氰酸钠的质量分数检测。其检测限和定量限都能达到和离子色谱相同的质量分数水平，而且前处理方法简便，检测结果准确可靠。

[1]朱明华.仪器分析[M].北京：高等教育出版社,2000：70-71.

[2]张玉奎,王杰,张维冰译.实用高效液相色谱法的建立[M].北京：华文出版社,2001：377-378.

[3]盛龙生,何丽一,徐连连,等.药物分析[M].北京：化学工业出版社,2003：240-242.

Determination of sodium thiocyanate in milk by HPLC

WU Jian-ping,GU Xin,LI Dan-ni,YAN Feng,ZHANG Xin
（Shanghai Institute for Veterinary Drug&Feedstuffs control，Shanghai 201103，China）

A method to determinate sodium thiocyanate in milk by RP-HPLC was established.The separation was performed on Agela-ASB

C18 column（250mm×4.6mm，5 μm）with the mobile phase of phosphoric acid solution（0.2%,V/V,A）：methanol（B）=95∶5.The detection wavelength was 218 nm.The flow rate was 0.8 mL/min and the column temperature was 30℃±2℃.Good linearity was showed within the range of 5～500 mg/L respectively,r＞0.9995.The average recoveries was larger than 90.0%respectively,RSD＜10%.The method was simple,rapid and reliable for the simultaneous determination of sodium thiocyanate in milk with the LOD of 0.2 mg/kg and the determination range of 0.5～50 mg/kg.

sodium thiocyanate﹔HPLC﹔reverse phase ion pair chromatography identification

TS252.7

A

1001-2230（2011）07-0044-03

2011-03-03

吴剑平（1983-），男，畜牧师，研究方向为残留测定。