紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应研究

孙爱杰，孙本风，赵纯洁

（黑龙江飞鹤乳业有限公司，a检测中心；b.研发中心（北京）；黑龙江 齐齐哈尔 161006）

紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应研究

孙爱杰a，孙本风b，赵纯洁a

（黑龙江飞鹤乳业有限公司，a检测中心；b.研发中心（北京）；黑龙江 齐齐哈尔 161006）

枯草芽孢杆菌是一种无毒副作用、无残留的绿色饲料添加剂，研究表明，可以利用枯草芽孢杆菌进行生物防治或生产微生物杀菌剂以替代剧毒化学药品。利用紫外线对枯草芽孢杆菌进行诱变，通过实验紫外线处理150 s时致死率几乎为100%，120 s时诱变效果最好，对大肠杆菌的抑菌效果最明显。

枯草芽孢杆菌；紫外线；诱变

Kew words：Bacillus subtilis；ultraviolet radiation；mutagenic effects

0 引 言

近年来，枯草芽孢杆菌的研究和使用发展极为迅速。紫外线作为物理诱变因子用于工业菌种的诱变处理具有悠久的历史。目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌中，有80%左右是通过紫外线诱变处理后经筛选而获得的[1]。本文通过实验来了解一下紫外线对枯草芽孢杆菌的诱变效应。

1 枯草芽孢杆菌及其应用

1.1 枯草芽孢杆菌的结构与生物学特征

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。单个细胞（0.7～0.8）×（2～3）μm，着色均匀。 无荚膜，周生鞭毛，能运动。 革兰氏阳性菌，芽孢（0.6～0.9）×（1.0～1.5）μm，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。枯草芽孢杆菌是一种无毒副作用、无残留的绿色饲料添加剂。其产品中含有的活菌是以内生孢子的形式存在的，能耐酸、耐盐、耐高温及耐挤压，在配合饲料制粒过程中以及通过酸性胃环境时比较稳定。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌为“公认安全（GRAS）”的细菌[2]。我国于1994年批准使用的益生菌有6种，芽孢杆菌就是其中之一。“促菌生”和“调痢生”均是国内较早研制成功的蜡样芽孢杆菌微生态制剂[3]。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名[4]。通过分泌多种消化酶，芽孢杆菌能够促进动物对饲料中营养物质的消化；通过分泌维生素及氨基酸等营养物质供动物利用，可以促进动物的生长；通过抑制动物体内的有害菌，可以起到预防动物疾病，优化养殖环境的作用[5]。

1.2 枯草芽孢杆菌的功能

生物夺氧；拮抗致病微生物，改善体内外生态环境；增强动物体的免疫功能；产生多种消化酶；产生多种营养物质。芽孢杆菌在动物肠道内生长繁殖，能产生多种营养物质如维生素、氨基酸、有机酸、促生长因子等，参与动物机体新陈代谢，为机体提供营养物质[6]。

1.3 紫外线的诱变作用

1.3.1 诱变的分类

物理诱变、化学诱变、空间技术诱变、复合诱变等[7]。

1.3.2 紫外线的特性

太阳光和人工光源中含有不可见的紫外线，紫外线是一种位于X射线和可见光波之间的电磁波，其波长在200～400 nm又称紫外辐射[8]。

1.3.3紫外线的作用机理

紫外线是波长136～390 nm的短于紫外波长的射线，它是一种非电离辐射，能使被照射物质的分子或原子中的内层电子提高能级跃迁到能量高的外层轨道（称为激发），导致分子的理化变化[9]。

1.3.4 紫外线的使用方法

测定紫外光的剂量有直接法 （以尔格/平方毫米表示绝对剂量）和间接法（以辐照时间或致死率作为相对剂量）两种。一般用15W的紫外灯，距离固定在30 cm左右，选用致死率达90%～99.9%所需的辐射时间进行诱变处理。

辅射不宜在肉汤等成分复杂的液体中进行，以免化学反应的干扰；同时要有电磁搅拌设备，以求照射均匀，尤其在菌液浓度较大或菌体、孢子等较大而重时很容易在处理期间发生沉降，此时电磁搅拌更显重要。照射前紫外灯宜先开灯预热20～30 min，使光波稳定[10]。

2 实 验

2.1 材料与设备

枯草芽孢杆菌（B.subtilis）；生理盐水，牛肉膏，蛋白胨，琼脂，氯化钠，氢氧化钠溶液；氯仿，液体牛肉膏蛋白胨培养基，固体牛肉膏蛋白胨培养基[11]。

1 mL，5 mL移液管，烧杯，锥形瓶，酒精灯，磁力搅拌器，离心机，高压灭菌锅。

2.2 步骤

2.2.1 制备菌悬液

（1）取已培养48 h的活化枯草芽孢杆菌斜面4～5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并装入盛有转子的平皿中，放在磁力搅拌器上强烈振荡，以打碎菌块，使之搅拌均匀。

（2）将菌液离心（3 000 r/min）15 min,弃上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2次，最后制成菌悬液。

（3）用血球计数板在显微镜下直接计数。调整细胞数为108mL-1。

2.2.2 配制培养基

（1）制作液体和固体牛肉膏蛋白胨培养基。

（2）将固体牛肉膏蛋白胨培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板，凝固后待用。

2.2.3 配制无菌生理盐水

将氯化钠0.9 g蒸馏水1 000 mL溶解，进行121℃，20 min高压蒸汽灭菌，

2.2.4 紫外线处理

正式照射前开启紫外灯预热约20 min。分别取制备好的菌悬液3 mL移入5个直径为6 cm的无菌培养皿中，在摇匀。15W紫外灯下30 cm处分别搅拌照射30，60，90，120，150 s。 不同诱变时间处理的菌悬液各取1 mL加入液体牛肉膏蛋白胨培养基中37℃黑暗下培养24 h。同时取1 mL未经诱变的菌悬液培养作为对照。

2.2.5 涂平板

培养24 h后，在红光（酒精灯光）下，分别取上述经诱变处理的菌悬液1 mL于装于9 mL无菌水的试管中，摇匀；再从中吸取1 mL菌悬液，重复上个步骤，直至稀释到10-4。用异步培养法[12]挑选高产单菌落。即将稀释到10-5的菌悬液涂布平板，然后将其倒扣于装有一薄层氯仿的培养皿盖熏蒸50 min，让菌落固定在固体牛肉膏蛋白胨培养基表面。移去培养皿盖，让平板中的氯仿挥发40 min。 再取0.5 mL菌数为107～108mL-1的大肠杆菌菌悬液涂布在平板上。待平板晾干后培养72 h。

3 结果与讨论

将培养72 h后的平板取出进行细胞计数。根据平板上菌落数，计算出致死率，即

表1 照射时间与致死率对比结果

由图1和图2可以看出，枯草芽孢杆菌在15W，30M处紫外诱变不同时间，30 s时致死率最低，但其正突变率太小。随时间的增加，致死率越来越大，150 s时菌种几乎全部被杀死。60,90,120 s 3个时间段的致死率相差不大，其中在诱变时间为120 s时效果最好。在此时诱变菌株的抑菌圈最大，正突变率（诱变后抑菌圈比诱变前抑菌圈增大的比例）最高外，致死率也是可以接受的范围。

4 结束语

本文只做了在不同时间的紫外线照射下枯草芽孢杆菌的致死率和对大肠杆菌的抑菌作用的关系，还可以通过实验了解不同时间对抑菌效果的影响和不同接种量对抑菌效果的影响。

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[12]TAGG J R,MCGIVEN A R,Assay System for Bacteriocins[J].Applied Microbiology,1971,21：943.

Study of mutagenic effects of Bacillus subtilis using ultraviolet radiation

SUN Ai-jiea，SUN Ben-fengb，ZHAO Chun-jiea
（Heilongjiang Feihe Dairy Co.Ltd.,a.Key Laboratory；b.R&D Center（Beijing）,Qiqihar 161006,China）

Bacillus subtilis is a non-toxic and non-residual green feed additives.Research shows that Bacillus subtilis can be used for biological control or production of microbial fungicides to replace toxic chemicals.The use of UV-mutagenesis in Bacillus subtilis can achieve almost 100%death rate during experiment when treating 150 s.The mutagenic effect is the best when treating 120 s and the antibacterial effect against E.coli is most obvious.

Q936

A

1001-2230（2011）07-0012-03

2011-04-23

孙爱杰（1974-），女，助理工程师，从事乳品检验方面的研究。