绿色木霉发酵产木聚糖酶的培养条件研究

杜密英苏 琦杜进民

（1桂林旅游高等专科学校，桂林 541006） （2河北廊坊工商局，廊坊065000） （3河北科技大学，石家庄 050018）

绿色木霉发酵产木聚糖酶的培养条件研究

杜密英1*苏 琦2杜进民3

（1桂林旅游高等专科学校，桂林 541006） （2河北廊坊工商局，廊坊065000） （3河北科技大学，石家庄 050018）

以玉米芯为主要原料，探索绿色木霉发酵玉米芯产木聚糖酶的培养条件，进一步提高木聚糖酶的酶活。结果表明其产酶最佳培养条件为：接种量为5 mL（孢子1.3×107个/mL），初始pH值为6，玉米芯与水质量比为1∶2，温度为33℃，在培养到第4 d时，其酶活力最高达1 537.52 U/mL。

绿色木霉；木聚糖酶；培养条件

木聚糖酶是一类重要的木糖苷键水解酶，对水解植物中的半纤维素有着重要的作用，特别是利用木聚糖酶酶解可制得双歧杆菌增殖因子低聚木糖，国际上对木聚糖酶的研究十分重视。以木聚糖为碳源从而有选择性地生产木聚糖酶在木霉属和曲霉属微生物已经获得了成功。玉米芯含有丰富的木聚糖，疏松适度利于通气，表面积大，特别适合于好气性微生物生长。本文以玉米芯为原料，摸索了绿色木霉最适产酶条件，可大大提高绿色木霉产木聚糖酶的酶活。

1 材料与方法

1.1 试验材料

玉米芯采集于河北省石家庄市近郊；绿色木霉菌种由河北科技大学生物安全实验室提供。

1.2 化学试剂和仪器

1.2.1 DNS试剂的配制

A液：182 g酒石酸钾钠完全溶于500 mL蒸馏水中；B液：16 g氢氧化钠完全溶于250 mL蒸馏水中；C液：10 g 3，5-二硝基水杨酸完全溶于B溶液中；DNS试剂：将C液与A液混合，加入5 g苯酚，溶解后用蒸馏水定容至1 000 mL，用棕色瓶放置7 d，用细纱布过滤，避光保存。

1.2.2 Tris-HCl缓冲液的配制

0.1 mol/L盐酸溶液的配制：量取1 mL浓盐酸，加蒸馏水定容至100 mL；0.1 mol/L Tris溶液的配制：称取12.114 g Tris，加蒸馏水定容至1 000 mL；Tris-HCl缓冲液的配制：50 mL 0.1 mol/L Tris溶液，加入40.3 mL 0.1 mol/L HCl溶液，加蒸馏水定容至100 mL。

1.2.3 仪器

VIS-7220可见分光光度计，北京第二光学仪器厂；LRH-150S恒温恒湿培养箱，广东省医疗器械厂；LRH-300-GSⅡ微电脑控制人工气候箱，广东省医疗器械厂；D-1自动蒸汽灭菌锅，北京海淀仪器厂；A250生化培养箱，江苏省金坛市宏华仪器厂。

1.3 绿色木霉的培养

筛选培养基：磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、蛋白胨1 g、琼脂22 g、滤纸10 g、自然pH值、1 000 mL蒸馏水，灭菌冷却到50℃后加入1 mL链霉素（50万单位/mL）。

基础培养基：磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、蛋白胨1 g、琼脂22 g、滤纸10 g、自然pH值、1 000 mL蒸馏水，灭菌冷却。

发酵培养基：玉米芯10 g、磷酸二氢钾0.16 g、硫酸铵0.1 g、豆饼粉0.15 g、蒸馏水100 mL，灭菌冷却。

将少量土样用蒸馏水溶解，取2 mL加到筛选培养基中，涂布均匀，置于33℃条件下培养4 d。挑取绿色的菌落，转接到基础培养基中，33℃继续培养4 d。

发酵培养基接入5 mL孢子悬液，搅拌均匀，置于33℃条件下培养6 d。

1.4 制备方法

1.4.1 孢子悬液的制备

以基础培养基培养的绿色木霉菌株为出发菌株，用无菌生理盐水洗下平板上的孢子，置于50 mL的三角瓶中，33℃，振荡30 min，用脱脂棉滤去菌丝片断，血球计数板计数并调整孢子浓度为1.3×107个 /mL。

1.4.2 孢子浓度的检测

采用血球计数板对孢子悬液进行计数。

1.4.3 木聚糖酶粗酶液的制备

称取发酵4d的发酵曲10g，用100mL 0.1mol/L（pH值5.0） 柠檬酸缓冲液于30℃的环境下浸提2 h，过滤，4 000 r/min离心10 min，取滤液，即为木聚糖酶粗酶液。

1.4.4 木聚糖液的制备

玉米芯粉20 g，自来水清洗3次～4次，用去离子水浸泡2 h，纱布过滤取渣，用质量分数10%氢氧化钠200 mL煮沸60 min，冷却到室温，用纱布过滤取滤液，用浓盐酸中和到pH值为7，4 000 r/min离心10 min，沉淀干燥，得到粗木聚糖。称取粗木聚糖5 g，100 mL去离子水溶解，得到粗木聚糖液。

1.5 测定方法

1.5.1 还原糖含量的测定

取木聚糖液0.5 mL，空白用去离子水，用Tris-HCl补至2.0 mL，加入DNS试剂1.5 mL，于沸水浴中加热反应5 min，冷却，摇匀，过滤，取滤液，于540 nm处测吸光度，根据回归方程求得还原糖的含量。

标准曲线的绘制：准确称取干燥的木糖2.0 g，加去离子水溶解，定容至100 mL，此为标准木糖溶液，质量浓度为2 mg/mL。分别取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL标准木糖溶液，加到10 mL试管中。每个试管中加Tris-HCl补至2 mL，再各加DNS试剂1.5 mL，充分混匀后，于沸水浴中加热反应5 min，然后迅速用冷水将其冷却至室温，摇匀，于540 nm处测吸光度。以吸光度为横坐标，木糖质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线，如图1所示。注意，每个测定值都要有重复。每重新配置一次DNS，必须重新做一条标准曲线。

图1 还原糖-吸光度标准曲线

1.5.2 木聚糖酶酶活的测定

木聚糖酶在一定条件下水解木聚糖，释放出还原糖（以木糖计算） 与3,5-二硝基水杨酸（DNS）反应，产生颜色变化，这种颜色变化与释放的还原性糖（以木糖计算）的量成正比关系，即与酶样品中的酶活性成正比。通过在540 nm的光吸收值查对标准曲线（以木糖为标准物）可以确定还原糖产生的量，从而确定出酶的活力单位。

参照参考文献［5］G.L.Miller等的法具体操作如下：

取经过适当稀释的粗酶液0.5 mL，加入2.0 mL木聚糖液，55℃条件下准确反应10 min之后，加入1.5 mL DNS试剂，充分混合均匀后，于沸水中煮沸5 min，取出，迅速用冷水将其冷却至室温，最后在540 nm吸光度下测定吸光度值，以空白对照调零。

空白对照：取经100℃灭活适当稀释的粗酶液0.5 mL，加入2.0 mL木聚糖液，55℃条件下准确反应10 min后，加入1.5 mL DNS试剂，充分混匀后，于沸水中煮沸5 min，迅速用冷水将其冷却至室温，最后在540 nm下测定吸光度值。

酶活力单位定义为：试验条件下每分钟水解木聚糖形成相当1 μg木糖的还原糖所需的酶量，计算公式如下：

式中：N——酶液稀释倍数；

G——酶解溶液中木糖的含量，μg；

0.5——吸取的酶液体积，mL；

10——酶解时间，min。

1.6 绿色木霉发酵产木聚糖酶条件的优化试验

1.6.1 最适氮源的选择

采用发酵培养基，其中的氮源分别为硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨、玉米浆，经高温灭菌后，冷却，将孢子悬液分别接种到4种培养基中，在33℃下培养6 d，然后测定木聚糖酶酶活。

1.6.2 最适接种量的选择

采用发酵培养基，接种量分别为3 mL、5 mL、10 mL、15 mL，在33℃下培养6 d，然后测定木聚糖酶酶活。

1.6.3 最适pH值的选择

采用发酵培养基，其中的pH值分别为4、5、6、7，经高温灭菌后，冷却，将孢子悬液分别接种到4种培养基中，在33℃下培养6 d，然后测定木聚糖酶酶活。

1.6.4 最适玉米芯与水质量比的选择

玉米芯与水按质量比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4分别制成4种培养基，经高温灭菌后，冷却，将孢子悬液分别接种到培养基中，在33℃下培养6 d，然后测定木聚糖酶酶活。

1.6.5 最适温度的选择

采用发酵培养基，经高温灭菌后，冷却，将孢子悬液分别接种到培养基中，分别在23℃、28℃、33℃、38℃、43℃下培养6 d，然后测定木聚糖酶酶活。

2 结果与分析

2.1 最适氮源的选择

豆饼粉作为绿色木霉产木聚糖酶的氮源，含有促绿色木霉产木聚糖酶的生长因子，而且便宜易得，因此在选择氮源时，每种培养基中都添加豆饼粉。按照1.6.1的试验条件进行，每天测定绿色木霉产木聚糖酶酶活。氮源对绿色木霉产木聚糖酶的影响如图2所示。

图2 氮源对绿色木霉产木聚糖酶的影响

从图2可以看出：氮源对绿色木霉产木聚糖酶的影响较大。在4种氮源中，玉米浆促进绿色木霉产木聚糖酶的效果明显高于其他的氮源，可能是因为玉米浆含有丰富的营养物质，例如蛋白质、氨基酸和多种维生素等，而这些物质又是绿色木霉合成木聚糖酶所必需的，更有利于木聚糖酶的合成。当培养到第4 d时，木聚糖酶酶活达到最高。随着时间的延长，酶活降低，这可能是氮源逐渐减少，营养不足而不利于木聚糖酶的合成。

2.2 最适接种量的选择

接种量的大小对微生物生长周期有一定的影响，不同的微生物因其生理特性不同以及不同的生长时期，接种量各不相同。本试验选用3 mL、5 mL、10 mL、15 mL不同体积的孢子悬液（孢子的浓度为1.3×107个/mL） 接种到发酵培养基中进行培养，以研究最适接种量。接种量对绿色木霉产木聚糖酶的影响如图3所示。

从图3可以看出：在培养过程中，酶活均呈现出先升高后下降的趋势，在培养4 d之后，均达到产酶高峰，并且此时5 mL接种量的酶活高于其他3种接种量，因此，以5 mL的接种量为最佳。接种量过低，菌体生长缓慢，发酵延迟，导致产酶量不高；接种量过高，发酵周期短，但是在生成大量酶的同时也受到代谢产物的阻遏作用，从而影响酶的产量。

图3 接种量对绿色木霉产木聚糖酶的影响

2.3 最适pH值的选择

培养基的初始pH值对木聚糖酶的合成有重要的影响，pH值不仅影响细胞膜所带电荷，引起细胞对营养物质吸收状况变化，而且可以通过改变培养基中有机化合物分子进入细胞状况，而促进或者抑制微生物的生长。因此，培养初期以及培养过程中pH值直接影响微生物的生长和酶的合成。另外，微生物往往能同时产生好多种酶，每一种微生物都有各自最适生长pH值和产酶pH值，可以通过调控培养初期以及培养过程的pH值，来选择性合成某一种酶。Dokker研究认为里氏木酶QM9414合成木聚糖酶的最适pH值为4～5。Poutanen认为里氏木酶QM9414合成木聚糖酶的最适pH值为5.2，β-木糖苷酶的最适pH值为4.0。Bailoy等人在研究里氏木酶RutC-30合成木聚糖酶时发现，在培养过程中维持较高pH值能抑制维素酶的合成，提高木聚糖酶酶活和纤维素酶活的比值。刘超纲的研究也得到类似的结论。这对通过人工调控提高木霉选择性合成木聚糖的能力具有指导意义。

本试验通过改变发酵培养基的初始pH值来研究pH值对绿色木霉产木聚糖酶的影响。调节pH值分别为4、5、6、7，培养6 d。pH值对绿色木霉产木聚糖酶的影响如图4所示。

从图4可以看出，培养基的初始pH值不同，绿色木霉产木聚糖酶的酶活性明显不同。在pH值达到6之前，随着pH值的增大，木聚糖酶的酶活性逐渐升高；pH值为6时，木聚糖酶的酶活性最高，且在pH值5～6这个范围内，木聚糖酶的活性比较稳定；pH值大于6之后，木聚糖酶酶活随着pH值的增大而降低。因此培养基的初始pH值为6时，对于绿色木霉产木聚糖酶是最有利的。究其原因，可能是pH值为6时，能够有效地的影响细胞膜所带的电荷，使培养基中的有机化合物分子很容易地进入细胞，从而促进细胞对营养物质的吸收，加快酶的合成。

图4 pH值对绿色木霉产木聚糖酶的影响

2.4 最适玉米芯与水质量比的选择

固态发酵是指不溶性的底物在足够的湿度但没有游离水的状态下被微生物所发酵的过程。在固态发酵的过程中，底物的含水量是一个非常重要的工艺参数。本试验采用玉米芯为碳源，调整玉米芯与水质量的比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4，来研究玉米芯与水质量比对绿色木霉产木聚糖酶的影响，结果如图5。

图5 玉米芯与水质量比对绿色木霉产木聚糖酶的影响

图5显示，玉米芯与水质量比为1∶2、培养4 d时的酶活最高，可能是培养基质中适当的含水量能确保菌体良好的生长。含水量过低，不利于营养物质溶解与传递，菌株孢子萌发缓慢，产酶量低；含水量过高，使培养基表面粘连，导致培养基中容氧量不足和发酵热散失，而造成发酵不彻底。

2.5 最适温度的选择

温度是发酵培养过程中重要的参数之一，控制好温度可以减少其他酶的产生和分泌，提高木聚糖酶产量。据文献［14］报道，微生物发酵最适菌体生长温度与最适代谢产物合成温度往往存在差异。因此，有必要选择一个合适的发酵温度以保证菌体生长与产物合成的顺利进行。本试验研究了不同温度对绿色木霉产木聚糖酶的影响，结果如图6所示。

图6 温度对绿色木霉产木聚糖酶的影响

图6 温度对绿色木霉产木聚糖酶的影响

图6显示，木聚糖酶酶活性的变化规律具有一般酶的共性。随着温度升高，木聚糖酶活性上升，峰值出现在33℃，此时木聚糖酶酶活达到1 537.52 U/mL；之后随着温度的升高，活性开始下降，到43℃，几乎和23℃的酶活一致。当培养温度控制在33℃时，绿色木霉诱导合成木聚糖酶的水平较高，酶活达到1 537.52 U/mL，这与吴克等在木霉菌株T6木聚糖酶固态发酵条件和酶学性质研究结果有所不同。当温度低于28℃，不利于菌体生长，杂菌容易生长，易造成污染。当温度高于38℃，基质容易变干，甚至出现烧曲的现象。

由图6还可以看出，在氮源、玉米芯和水质量比、pH值和温度等培养条件都进行优化后，在第4 d酶活达到最高。这是因为固体培养基在高温灭菌时，有部分多糖水解，所以发酵开始时，基质中含有较高浓度的残留还原糖，这为细胞的快速生长提供了可快速吸收的营养物质。由于木聚糖酶系诱导酶，酶的合成会受到容易利用碳源的阻碍，加之发酵开始阶段的生物量较少，所以酶活力较低，至发酵第4 d时，木聚糖酶活力达高峰。培养第5 d，酶活力下降，所以此菌株固体发酵以4 d为宜。

3 结论

优化了绿色木霉产木聚糖酶的培养条件，主要对于接种量、初始pH值、固液质量比、温度等条件进行了研究。结果表明，产酶最佳培养条件为：接种量为5 mL（孢子1.3×107个/mL），初始pH值为6，玉米芯与水质量比为1∶2，温度为33℃，在培养到第4 d时，其酶活力最高达1 537.52 U/mL。

［1］ 周秀梅.木聚糖酶生产及酶学性质的研究［D］.浙江：浙江大学，2005：6-8.

［2］ 张强，马齐，徐升运.木聚糖酶降解玉米秸秆的工艺研究［J］.安徽农业科学，2008，36（34）：14 848-14 850.

［3］ 李丹.黑曲霉木聚糖酶的发酵性质及其应用研究［D］.长春：东北师范大学，2004：20-21.

［4］ 付五兵，朱涛，张勤良.Bacillus suttilis产木聚糖酶的酶学性质及其在禽饲料中应用的初步研究［J］.饲料工业，2005（16）：27-30.

［5］ G.L.MILLER.Use of dinitrosAlicylicacidreagent for determination of reducingsugar［J］.SnalChem，1959（31）：426.

［6］ 程海燕，张洁，吴克.产碱性木聚糖酶芽孢杆菌HIS的筛选及发酵条件研究［J］.工业微生物，2002，32（2）：30-32.

［7］ 杨燕凌.聚糖酶固体发酵条件的试验［J］.河南科技大学学报，2005，26（5）：93-96.

［8］ R.F.H.DEKKER.Emhancement in cellulase production by trichoderma reesei RUT C-30 due to citric acid［J］.Biotechnol Bioeng，1983（25）：1 127-1 146.

［9］ P.KOUTANNEN.Effect of pH on production of xylanase by trichoderma reesei on xylan and cellulose based media［J］.Biotechnol，1987（6）：49-60.

［10］P.BIELEY.Hemicellulose and hemicellulase［M］.Lond：Portland Press，1993：29-51.

［11］刘超纲.里氏木霉木聚糖酶的选择性合成及其应用基础研究.［D］.南京：南京林业大学，1999：87-92.

［12］ M.V.R.MURTHY.Biochemical Engineering Aspects of Solid-state Fermentation［J］.Advances in Applid Microb，1993（38）：99-147.

［13］吴克，刘斌，张洁.木霉T6木聚糖酶液态发酵生产研究［J］.食品与发酵工业，2000，27（3）：9-12.

［14］冉晓慧，颜景斌.变温培养在林可霉素发酵上的应用［J］.医药工程设计杂志，2003，24（5）：7-9.

［15］吴克，蔡敬民，刘斌.木霉菌株T6木聚糖酶固态发酵条件和酶学性质研究 ［J］.菌物系统，2001，20（2）：191-195.

Effect ofculture conditions on xylanase activity produced from trichoderma

DUMi-ying1*SUQi2DUJin-min3
1（Guilin institute oftourism，Guilin 541006，China）2（Langfangbureau ofindustryand commerce，Langfang 065000，China）3（Hebei universityofscience and technology，Shijiazhuang 050018，China）

The cultivation conditions were discussed.The most suitable carbon source in the culture media should be corncob，the most suitable nitrogen source was the corn thick liquid，the quantity of the inoculation should be 5 mL（1.3×107spores/mL），the initial pH value is 6，the proportion of the solid and liquid wais 1∶2，the temperature was 33℃，the time was 96 h.In these conditions could the enzymatic activityreach to1537.52 U/mL.

trichoderma viride；xylanase；cultivation condition

TS261.1+5

A

1673-6004（2011）04-0056-04

* 杜密英，女，1978年出生，2007年毕业于河北科技大学食品科学专业，硕士，助教。

2011-10-11