有氧运动对老年大鼠学习记忆及海马CA1区一氧化氮合酶表达的影响

付 芳,崔建梅,于 芳

有氧运动对老年大鼠学习记忆及海马CA1区一氧化氮合酶表达的影响

付 芳,崔建梅,于 芳

目的:探讨有氧运动对老年大鼠学习记忆能力、血清睾酮及海马CA 1区nNOS表达的影响。方法:选择SD雄性老年大鼠,分成老年对照组及有氧训练组。对照组不运动,有氧训练组采用递增负荷训练,连续8周。8周后检测血清睾酮,测试大鼠空间学习记忆能力,对海马CA 1区nNOS神经元的数量、面积及灰度进行测量和分析。结果:1)与老年对照组比较,有氧运动组大鼠血清睾酮水平增高(P<0.05),完成八臂迷宫时间缩短,错误次数显著减少(P<0.05);2)与老年对照组比较,有氧运动组海马CA 1区nNOS免疫阳性细胞数量和阳性产物面积均增加(P<0.05)。结论:有氧运动可提高老年大鼠的记忆能力,机理可能与长期有氧运动提高老年大鼠的血清睾酮水平及增强大脑海马CA 1区nNOS的表达有关。

有氧运动;学习记忆;雄激素;海马;nNOS;鼠;动物实验

衰老是人类生命过程中整体形态、结构和功能逐渐衰退现象的总称。伴随生殖衰老所发生的性激素分泌改变,不仅导致生殖功能减退,也影响到神经系统,学习记忆伴随着机体的老化,也出现了明显减退。近年来,随着世界人口的老龄化趋势,老年人学习记忆能力减退相关疾病的发生率逐年上升,引起国内外的关注。据研究,适宜的运动训练可以强身健体,促进身体健康,同样,越来越多的研究也表明,适宜的运动训练也可以促进心理健康,从而有利于全面的身心健康。人和动物实验都证明了运动可以改善认知功能[10,24],但是,具体机制尚不清楚。现有的资料表明,雄激素水平与老年认知功能有密切关系[8,31]。海马(Hippocampus)是研究动物和人类学习记忆、情绪、行为功能的经典脑区,海马神经的突触可塑性可直接影响学习与记忆功能[9],而海马CA 1区神经元与动物的学习记忆能力密切相关[6],是长时程增强(LTP)形成及学习记忆的重要部位。NO作为一种神经递质在神经元之间起信息传递作用,参与神经发育、调节导向轴突生长,尤其在学习与记忆过程中发挥重要作用[20]。NO不稳定,现多以生成NO的酶(NOS)表示NO的活性。NOS是一种同工酶,有3种亚型:神经元型NOS(nNOS)、内皮型NOS (eNOS)和诱导型NOS(iNOS)。研究表明,nNOS在海马(尤其CA 1区)nNOS表达较多,而且,与学习及记忆过程有关[11]。因此,本实验以海马CAl区为研究重点,观察老年大鼠有氧运动8周后,大鼠血清睾酮水平,测试大鼠空间学习记忆能力及海马CA 1区nNOS的变化,探讨有氧运动提高老年大鼠记忆能力的可能机制。

1 材料及方法

1.1 动物及分组

雄性健康老年SD大鼠24月龄40只,体重330～350 g,成年组20只,体重200～250 g,均由山西医科大学动物饲养中心提供,标准啮齿类饲料饲养,自由摄食和饮水,室温(20±2)℃,湿度(45±10)%。将40只老年大鼠随机分为2组:即老年对照组、有氧运动组,每组20只,成年对照组20只,其中每组10只用于睾酮水平的测试,其余10只用于八臂迷宫及大脑NOS的测试。

1.2 试剂

睾酮放射免疫试剂(天津德普生物技术医学产品有限公司);一氧化氮合酶(nNOS)测定试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 训练方案

成年对照组,老年对照组不施加任何干扰因素,笼中自由饮食、饮水、自由活动。有氧运动组运动8周,运动负荷参照Bedford跑台训练方法略加改动。有氧训练组适应性训练3 d,正式实验时,起始训练速度为15 m/min,时间为15 min,递增速度3 m/min、时间5 min,运动至速度为20 m/min,时间为60 min后增加跑台坡度为5°,每周5 d,共8周。每组大鼠各取10只麻醉后通过大鼠心脏取血,低温离心分离血清,置于4℃冰箱保存,用放射免疫分析法测睾酮。

1.4 八臂迷宫实验程序

正式实验前,先对每组剩余10只大鼠进行训练,训练前所有大鼠先在迷宫中适应2 d,每天2次。适应时3～4只大鼠同时置于迷宫中,自由活动和摄取食物10 min。适应后进行每天2次的训练。每次训练中,八臂中只有四臂放置了食物(分别为1、3、4、6号臂),整个实验过程均维持此顺序。第9周周三进行八臂迷宫实验,将大鼠置于迷宫中央区,此时中央区四周用鼠门关住15 s后将门打开并开启分析测试软件。大鼠可选择进入任意一臂,以摄取食物。大鼠进入有食物的臂且摄取了食物为1次正确选择;当大鼠正确选择了四臂食物为完成八臂迷宫的时间,一次训练结束。分析记忆的记录参数为进入不放食物臂称为错误选择的次数,每只大鼠测试2次,取平均值进行统计分析。

1.5 脑组织的取材与切片

行为测试结束后即刻,大鼠经2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉动物(50 mg/kg),打开胸腔,从心尖将穿刺针插入升主动脉,然后迅速剪破右心耳,300 ml冷生理盐水快速冲洗血管,随后灌入4%多聚甲醛(0.1 mo l/L PBS配制, p H 7.4)300 m l,进行前固定,再以10%蔗糖PBS液灌入300 m l,灌注结束后迅速取脑,取出放在4%多聚甲醛PBS溶液中4℃后固定2 h,再浸入20%蔗糖PBS溶液中4℃保存过夜。组织完全沉底后,脑冠状位连续冰冻切片,片厚40μm,隔4张取1张。

1.6 ABC免疫组织化学染色

切片经0.5%Triton X-100 PBS液孵育(37℃)1 h,然后加入10%山羊血清工作液孵育(37℃)1 h,加入c-fos血清第一抗体(兔抗鼠),37℃孵育5 h后,4℃再孵育36 h;随后加入生物素羊抗兔第二抗体,37℃孵育1 h;接着入卵白素生物素复合物中,37℃孵育40 min,以上各步骤均用0.01M PBS(p H 7.2～7.4)5 min×3次充分漂洗3遍(每次5 min);DAB呈色,缓冲液中止显色,用蒸馏水反复漂洗。0.2%明胶裱片,梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。

1.7 图像分析和统计学处理

用数码生物显微镜和江苏捷达形态学显微图像分析系统,参照大鼠脑立体定位图谱测定大鼠海马CA 1区的nNOS免疫阳性产物。每组大鼠各随机选取20张海马CA 1区nNOS的片子在10×40倍下进行测量,计数阳性细胞个数、阳性产物面积和灰度。

采用SPSS 3.0统计软件包进行统计分析,描述性资料采用平均数±标准差表示,采用单因素方差分析法,检验水准a=0.05。

2 实验结果

2.1 大鼠血清睾酮测试结果

表1结果显示,与成年对照组比较,老年对照组及有氧训练组大鼠血清睾酮水平明显降低(P<0.01);与老年对照组比较,有氧训练组大鼠血清睾酮水平显著增高(P< 0.05),平均值增加61.12 ng/dl,提示长期有氧运动可以增加雄性老年大鼠的血清睾酮水平。

2.2 大鼠八臂迷宫测试结果

表2结果显示,与成年对照组比较,老年对照组及有氧运动组完成八臂迷宫时间显著增加(P<0.01,P< 0.05),增加幅度分别为44%及29%;与成年对照组比较,老年对照组的错误臂数显著增多(P<0.01),平均增加3次;而有氧运动组错误次数比成年对照组平均值增加1次,但没有显著差异(P>0.05);与老年对照组比较,有氧运动组错误次数显著减少(P<0.05),减少2次,完成八臂迷宫的时间显著减少(P<0.05),减少77.22 s,提示有氧运动可以改善老年大鼠的学习记忆能力。

2.3 各组大鼠海马CA 1区nNOS免疫阳性细胞数量、面积及灰度

从图3可见,海马CA 1区nNOS阳性表达产物为深褐色,染色均匀,但细胞核未被染色,突起较明显。测量结果显示,与成年对照组比较,老年对照组及有氧训练组海马CA 1区的nNOS免疫阳性细胞数量及面积均显著减少(P<0.01,P<0.05),灰度没有显著差异(P>0.05);与老年对照组比较,有氧训练组海马CA 1区的nNOS免疫阳性细胞数量和阳性产物面积表达均增加(P<0.05),灰度增加,但没有显著差异(P>0.05)(表3,图3)。

表1 大鼠血清睾酮测试结果一览表(X±S)Table 1 Results of testosterone blood plasma in rats

表2 大鼠八臂迷宫测试结果一览表( ±S)Table 2 Results of 8-arms radial maze in rats

表2 大鼠八臂迷宫测试结果一览表( ±S)Table 2 Results of 8-arms radial maze in rats

注:##P<0.01,#P<0.05,与成年对照组比较;Compared with the adult control group;＊P<0.05,与老年对照组比较;Compared with the aged control group。

例数(n)完成八臂迷宫时间(s) time of 8-arms radial maze(s)错误的臂数erro r frequency成年对照组the adult control group 10 360.32±87.89 3.11±1.12老年对照组the aged control group 10 527.45±103.56##6.01±2.56##有氧运动组the aerobic training group 10 450.23±87.54#＊4.12±1.85＊

表3 各组大鼠海马CA1区n NOS免疫阳性细胞数量、面积和灰度一览表(X±S)Table 3 Number,area and gray degree of n NOS immunopositive neurons in the hippocampus CA1

图1 大鼠脑切片图(箭头所示海马CA 1)Figure 1 The brain slices of rats(Hippocampus CA 1)

3 讨论

3.1 有氧运动对老年雄性大鼠血睾酮水平及学习记忆能力的影响

下丘脑-垂体-性腺轴功能衰退是人类衰老的主要环节,人在进入老年期后由于血管硬化,供血不足等原因使睾丸发生逐渐萎缩或纤维化,睾丸间质细胞数量逐渐减少,细胞内脂褐素增多,加之睾丸组织促性腺激素受体数目减少,或敏感性下降,导致睾酮水平低下[2]。本研究得出了相同的结果,与成年对照组相比,老年对照组大鼠的血清睾酮水平显著下降,平均值下降98.91 ng/dl,下降幅度为30%,而经过8周的训练,血清睾酮水平显著增加,尽管远低于成年对照组,但与老年对照组相比显著增加,平均值增加61.12 ng/dl。

认知功能包括感知觉、记忆、注意、语言、思维、意识、情感、结构运用及高级执行能力、定向力和自知力等。认知功能随着年龄的增加有下降趋势,而老年人的性激素水平随着年龄的增加也有下降趋势,研究发现,性激素水平的变化与认知功能有密切关系。MULLER等对400例40～80岁之间的男性进行横断面研究,检测睾酮水平和记忆功能,发现睾酮水平和记忆呈倒U形曲线关系[17]。

图2 海马CA1区NOS阳性神经元(100倍)图Figure 2 The distribution of the nos in the Hippocampus CA1

图3 海马CA1区NOS阳性神经元分布图Figure 3. The distribution of the nos immunoreactive neurons in the Hippocampus CA1

八臂迷宫已被公认为是一种比较理想的学习和记忆模型,动物通过观察周围一些固定的参照物,经过反复识认,从而在其脑内将参照物同空间方位联系起来,来学习和记忆自身与饵(置于迷宫臂末端的白色小食丸)的相对位置,获得辨别该空间方位的能力,是一种评估啮齿动物空间学习记忆能力的工具,已被广泛接受和应用[5,23]。在本实验中,与老年对照组比较,经过8周跑台运动,老年大鼠完成八臂迷宫时间显著缩短,平均时间缩短77.22 s;臂的错误次数显著减少,平均值减少2次,说明长期有氧运动可以改善老年大鼠脑组织形态和结构上的退行性变化,进而改善学习记忆能力下降及老年健忘等症状,这与Evers等研究结果一致[12]。老年大鼠经过长期跑台运动后血清睾酮水平增加,因此,可以推断长期有氧运动增强记忆能力可能与血清睾酮水平的增加有关。

3.2 有氧运动对老年大鼠海马CA 1区nNOS表达的影响

海马是内侧颞叶系统中与学习记忆最密切相关的结构,大量研究发现,海马参与空间学习记忆能力,是将短时记忆转化为长时程记忆(即记忆巩固)所必需的,而且,在陈述性记忆的形成过程中也发挥重要作用[15],海马CA 1区又与海马内部及海马外结构有广泛的纤维联络,是长时程增强(LTP)形成及学习记忆的重要部位[13]。NO作为一种神经递质在神经元之间起信息传递作用,与学习记忆密切相关,主要表现在一氧化氮可影响突触长时程增强,可调节与学习记忆相关的神经递质的释放,增强学习记忆[26]。据报道,NO可以调节不同的学习及记忆过程,例如学习动机、嗅觉学习及空间学习等[25]。Paul等研究发现,老年大鼠记忆减退与海马NO减少有关,注射L-精氨酸可以增强大鼠的认知能力[21];国内李宁川等研究表明,8周中等负荷的运动训练可增加大鼠脑组织中cNOS活性,对改善大脑的功能有一定的作用,并认为运动时血流速度加快、切应力增加及细胞内Ca2+浓度升高可能是导致脑组织中cNOS活性升高的机制之一[1]。

本研究结果显示,老年对照组nNOS显著减少,与Wen等[30]研究结果一致,有氧运动组大鼠跑台运动8周后即刻海马CA 1区内nNOS阳性细胞及面积明显增多,提示老年大鼠长期有氧运动提高学习记忆能力可能与海马CA 1内nNOS表达增强有关,但是,海马CA 1区nNOS增强的机制仍不清楚。可能由于长期有氧运动使兴奋性氨基酸大量释放[3],导致Ca2+内流[4],激活nNOS使海马CA 1区nNOS表达增多。NO作为一种逆向信息传递物质参与LTP的产生和维持的观点也已被学术界广泛认同[7,22]。采用NOS抑制剂可阻断的L TP的形成[28],长期有氧运动激活NOS催化L-Arg产生NO[19];NO可自由而迅速地透过细胞膜,进入突触前成份,激活可溶型鸟苷酸环化酶(sGC), NO使sGC活化后引起细胞内cGMP水平升高[14],进一步促进谷氨酸合成及递质释放[16];谷氨酸再作用于突触后天门冬氨酸(NMDA)及非NMDA受体而实现对LTP的诱导[29],Shimizu等认为,NMDA受体是运动引起海马神经元再生的关键因素之一[27]。近年来的研究还表明,雄激素可促进NO的合成,具有抗氧化、抗兴奋性毒素,并通过调节胆碱能神经系统、神经营养因子或神经生长因子等而保护神经元,并可能通过NO等来调节突触的可塑性而增强学习记忆能力[18]。

本实验老年大鼠通过长期有氧跑台运动,血清睾酮水平显著增加,海马nNOS阳性神经元的数目和面积均明显增高,提示有氧运动可能通过增加睾酮水平、调节神经递质或神经生长因子、增强nNOS活性诱导L TP的形成,从而增强老年大鼠的学习记忆能力,具体机制有待于进一步研究。

4 小结

1.老年大鼠机体血清睾酮水平显著下降,记忆力显著减弱,长期有氧运动可以增加血清睾酮水平,从而增强老年大鼠的记忆能力。

2.老年大鼠海马CA 1区nNOS的表达显著减少,长期有氧运动可以增加海马CA 1区NOS的活性,增加NO的水平,从而增强老年大鼠的记忆能力。

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Influence of the Aerobic Train ing on Learning and Memory and NOS Expression within Hippocampus CA1 in the Aged Rats

FU Fang,CU IJian-mei,YU Fang

Objective:To exp lo re the influence of the aerobic training on learning and memo ry, the level of serum testosterone,and expression of nNOS w ithin Hippocampus CA 1 of brain in the aged rats.M ethods:SD aged rats(24-mouth)were chosen and random ly divided into 2 groups:the aged control group and the aerobic training group.The control group kep t no rmal activities and the aerobic training group undertook the 8-week training w ith p rogressively increasing load.Then each animal’s capability of learning and memo ry and the level of serum testosterone w ere examined,and nNOS expression w ithin Hippocampus CA 1 w as detected and analyzed.Results:1)Compared w ith the aged group,the level of testosterone of blood p lasma increased(P<0.05),the time of comp leting 8-arm s radial maze sho rtened(P<0.05),erro r frequency significantly decreased(P<0.05)in the aerobic training group;2)Compared with the aged group,the amount and area of nNosw ithin Hippocampus CA 1 obviously increased(P<0.05)in the aerobic training group.Conclusion:The aerobic training may enhance the learning and memo ry ability of the aged rats,and its mechanism m ight be that aerobic training increase the level of serum testosterone and reinfo rced exp ression of nNOS w ithin Hippocampus CA 1 at the same time.

aerobic training;learning and mem ory;testosterone;H ip pocam pus CA1;nNOS

中北大学体育与艺术学院,山西太原030051 School of Physical Education,North University of China,Taiyuan 030051,China.

G804.7

A

1000-677X(2011)11-0042-05

2011-09-16;

2011-10-19

国家自然科学基金项目(30671019)。

付芳(1978-),女,山西人,讲师,硕士,研究方向为运动与中医康复,E-mail:lionlian007@163.com;崔建梅(1972-),女,河北人,讲师,硕士,研究方向为运动与中医康复;于芳(1968-),女,山西人,教授,硕士,硕士研究生导师,研究方向为运动与中医康复。