运动训练对大鼠冠状动脉TGFβ和TNFα表达的影响

吴晓杰 董听 汪晓瑞 田振军

（1.陕西师范大学体育学院 西安 710062）

运动训练对大鼠冠状动脉TGFβ和TNFα表达的影响

吴晓杰1董听1汪晓瑞1田振军1

（1.陕西师范大学体育学院 西安 710062）

目的：探讨不同强度训练对大鼠冠状动脉TGFβ和TNFα表达的影响。方法：采用跑台训练方式建立大鼠有氧运动和疲劳运动模型，运用免疫组织化学SABC法研究不同运动强度对大鼠冠状动脉TGFβ和TNFα表达的影响。结果：有氧运动组与对照组比较，冠状动脉TGFβ的MOD值虽有降低但并不显著，TNFα的MOD值明显降低(P＜0.05)，疲劳运动组与对照组和有氧运动组比较，冠状动脉TGFβ和TNFα表达有显著性差异(P＜0.05)。结论：有氧训练可使TGFβ和TNFα 适度表达,疲劳训练会导致大鼠冠状动脉TGFβ和TNFα过量表达。因此认为运动训练与TGFβ和TNFα表达变化关系密切。

运动训练；冠状动脉；大鼠；TGFβ；TNFα ；免疫组织化学

冠状动脉心脏病（coronary heart disease,CHD）简称冠心病，是严重威胁人民健康的常见病。冠心病尤其是急性心肌梗死(AMI)的发病率呈明显上升趋势。转化生长因子（TGFβ）属于多肽生长因子，是具有多种生物功能的细胞因子，调节细胞生长分化、组织修复、参与炎症和免疫等作用。有研究报道，TGFβ可能作为保护因子参与了CHD的病理过程[1]。肿瘤坏死因子TNFα(tumor necrosis factor alpha)也是一种多功能细胞因子，主要功能是激活其他细胞因子和调节细胞的分化、增殖、坏死或凋亡，抗癌比活性高，能选择性地使肿瘤发生出血坏死，对正常细胞无影响。它对广范围的肿瘤有细胞毒副作用，且无种数特异性。研究表明，CHD伴代谢综合症（MS）患者TNFα水平明显高于CHD不伴MS患者[2]。其主要机制可能为TNFα抑制胰岛素受体的自身磷酸化，影响肌细胞及脂肪细胞转运蛋白的表达、蛋白合成及向细胞表面的转位，高浓度时可减少胰岛素受体的数目，使低密度脂蛋白( LDL)及血糖水平升高，高密度脂蛋白(HDL )水平降低，从而损伤血管内膜细胞，促进脂质穿透血管膜，导致凝血纤溶系统紊乱和血栓形成，促进动脉粥样硬化[3]。目前，有关病理条件下冠状动脉结构与功能变化及其机制研究报道较多[4-5]。但是对于生活方式干预包括运动锻炼的强度及其重塑冠状动脉结构与功能的机制研究报道尚少见。本文主要研究不同强度运动训练后，大鼠冠状动脉内皮细胞内的TGFβ和TNFα表达效果的差异，对冠状动脉疾病的预防和治疗有重要的临床和生物学意义。

1 实验对象与方法

1.1 实验方法 雄性SD大鼠24只（由西安交通大学医学院动物管理中心提供），3月龄，体重223.4±3.2g，国家标准啮类动物饲料喂养，自由饮食，室温17℃-25℃，湿度45-60%。随机分为正常对照组、有氧训练组和大强度疲劳组。有氧训练组和大强度疲劳组采用递增负荷方式进行跑台训练，运动负荷参照Bedford的研究进行。对照组正常笼内喂养不运动。有氧训练组为5d/wk，共8wk。起始速度为15 m/min，时间为20 min。递增速度3 m/min，时间5 min，运动至速度为20 m/min后，增加跑台坡度5%，时间为60 min。疲劳训练组为6d/wk，共8wk。递增速度3 m/min，时间5min，运动至速度为35 m/min后，增加跑台坡度10%，时间为60 min。

1.2 取材与样本制备 20%乌拉坦腹腔麻醉，迅速开胸摘取心脏，中性甲醛固定，石蜡包埋、切片（厚5 µm）常规脱蜡至水。

1.3 免疫组化染色 采用SABC法，按试剂盒（博士德）说明书操作步骤进行。切片用去离子水冲洗，3%H2O2封闭，经微波抗原修复15 min，PBS冲洗加生物素封闭液A 10 min滴加正常非免疫血清滴加一抗（TGFβ 和TNFα均为1：75兔抗小鼠、大鼠、人多克隆抗体博士德）4℃过夜复温，PBS冲洗滴加二抗PBS冲洗滴加SABCTween、PBS液冲洗，2hDAB显色脱水透明封片。每次染色设阴性对照染色PBS取代一抗。

1.4 数据采集与分析

免疫组织化学观察采用OLMPUS数码显微图像分析系统测定冠状动脉的平均光密度值（MOD），结果以均数±标准(± SD)差表示, 由SPSS软件包处理采用双因素析因方差分析P ＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 运动训练大鼠冠状动脉 TGFβ表达的平均光密度值比较 光镜下观察到冠状动脉VEC和VSMC胞浆阳性颗粒呈棕色或棕黄色。表1结果显示，与安静对照组比较，有氧运动组的TGFβ的MOD值有所降低而疲劳运动组的TGFβ的MOD值显著性升高；与有氧运动组比较，疲劳运动组的TGFβ的MOD值显著性升高。

表1 运动训练大鼠冠状动脉TGFβ的MOD值变化比较

2.2 运动训练大鼠冠状动脉 TNFα表达的平均光密度值比较 光镜下观察到冠状动脉VEC和VSMC胞浆阳性颗粒呈棕色或棕黄色。表2结果显示，与安静对照组比较，有氧运动组的TNFα的MOD值有所降低而疲劳运动组的TNFα的MOD值显著性升高；与有氧运动组比较，疲劳运动组的TNFα的MOD值显著性升高。

表2 运动训练大鼠冠状动脉TNFα的MOD值变化比较

3 分析与讨论

3.1 运动训练引起冠状动脉TGFβ表达变化的生物学意义

转化生长因子TGFβ广泛存在于动物正常组织细胞以及转化细胞中，是一族功能广泛的超家族多肽，是具有多种生物效应的细胞调节因子。在哺乳动物中的TGFβ有3种，分别为TGF-β1、TGF-β2 和TGF-β3。其中TGF-β1在体细胞中所占比例最高（90%），活性最强[6]。TGF-β1对心血管系统而言是重要的异构体，多在内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞和造血细胞中表达[7]。在血管平滑肌细胞（VSMC）、内皮细胞（VEC）和纤维母细胞中，低浓度TGF-β1增加细胞外基质的合成。蔡旭[8]等在实验中发现，在心肌梗死早期血TGF-β1确有升高。但随损伤心肌和内皮细胞的恢复，TGF-β1逐渐下降，血液TGF-β1最高是在心肌梗死初期，内皮和心肌损伤最重时，随着心肌梗塞的恢复，血清TGF-β1的水平呈下降趋势，证明 TGF-β1 是心肌梗死过程的保护性因素。也有研究报道[9]TGFβ1的高表达是心肌纤维化发生的主要调节因子，而心肌纤维化是多种心脏疾病发展到一定阶段的共同改变。本文研究发现，有氧训练后大鼠冠状动脉TGFβ的表达有所减弱。研究提示，有氧训练使血管活性增强，抑制了TGFβ调节细胞生长和转化，可能是运动抵抗多种心血管疾病尤其是冠心病的机制之一。

TGFβ的适量表达对机体产生有益的影响，但TGFβ的高表达不仅会引起强烈的血管舒张导致血压降低、抑制心脏功能，同时还会产生细胞毒性作用损伤机体组织。Michael 等[10]观察到，冠状动脉粥样硬化患者体内有活性的TGFβ水平降低，且与粥样硬化程度呈负相关，但外周动脉粥样硬化患者体内总TGFβ水平升高。已有研究表明TGFβ的高表达率是癌症的恶性表型之一。姚俊等通过实验证明，过度训练导致肾组织TGFβ表达的显著增加，是过度训练造成肾脏组织超微结构及功能损害的重要因素[11]。本文实验发现，疲劳训练组大鼠冠状动脉TGFβ的MOD值与对照组和有氧训练组比较均有显著性增加。推测疲劳训练可诱导冠状动脉VEC产生过量的转化生长因子，引起VEC的损伤和VSMC的增殖，可能是疲劳训练引起心血管功能降低的生物学因素之一。

3.2 运动训练引起冠状动脉TNFα表达变化的生物学意义

TNFα是一种重要的炎症细胞因子，出现在炎症反应早期，可调节脂类的代谢从而影响内皮功能和血管重建，与动脉硬化发生、发展有密切关系。研究发现，TNFα不仅来源于单核巨噬细胞系统，T淋巴细胞、B淋巴细胞、以及平滑肌细胞等也可释放TNFα[12]。TNFα作为一种主要的致炎因子，它促进中性粒细胞脱颗粒及氧化代谢，加速脂质过氧化，使氧化低密度脂蛋白生成增多，破坏内皮细胞的结构和功能完整性，使内皮细胞分泌血管活性物质平衡失衡，促进动脉粥样硬化的发生[13]。Krown等[14]利用单核细胞核微凝胶电泳法(彗星分析)检测凋亡细胞，探讨TNFa与细胞凋亡的关系，发现TNFa使培养鼠心肌细胞发生凋亡，且凋亡细胞数量与TNFa浓度呈正比。并且认为TNFa可以通过刺激心肌组织合成、释放NO，促进细胞凋亡的原癌基因表达的增强，以及促进凋亡基因FasmRNA的表达增强等途径来调节细胞凋亡的。目前多数研究表明，有氧运动可以降低TNFa的水平。但有关有氧运动对冠状动脉TNFα的影响未见报道。Monzillo 等[15]发现，肥胖受试者进行6个月的中等强度运动后，血清TNFα呈下降趋势。毛丽娟等[16]发现经过十周的递增负荷训练后，大鼠血清TNFa的含量与安静对照组相比有所下降。本文研究发现，经过8周有氧训练的大鼠冠状动脉TNFα与对照组比较表达有所下降，进一步说明了适当的有氧运动可以使TNFα的含量下降，其机制可能与TNFα的变化与细胞凋亡的易感性有关。实验结果提示，在适量运动的情况下，冠状动脉中细胞凋亡受到抑制，正常细胞的生存占优势地位，可能是增强冠状动脉功能，预防冠状动脉疾病的机制之一。

目前多数研究表明TNFα在多种病理状态下表达升高。资料显示，冠状动脉狭窄患者的血液TNFα的含量明显高于健康对照组，且TNFα的含量与粥样硬化斑块的程度有关，即病变越严重，TNFα生产量就越多[17]。TNFα在心衰患者血清中也有较高的水平。长时间大强度运动可引起血浆TNFα的升高。1993年Tilz报道长时间耐力运动的18位受试者血浆中TNFα受体含量明显增加[18]。Kimura[19]研究发现，男性青年进行30min恒定负荷功率车运动中，50%VO2max 强度的运动未引起血浆TNFα变化，但80%VO2max 强度的运动使血浆TNFα显著升高。本文研究显示经过8周疲劳训练的大鼠冠状动脉与对照组和有氧训练组比较，TNFα的表达显著性升高。进一步说明了长时间大强度运动可以诱导TNFα表达增加。而TNFα浓度的高低与细胞凋亡直接相关[14]。因此推测出机体在进行大强度疲劳性运动后，冠状动脉VSMC和VEC可能出现凋亡。这可能是大强度疲劳性运动后引起心血管机能发生改变的原因之一。

4 结论

长期有氧训练可使冠状动脉TGFβ和TNFα适度表达；而长时间疲劳训练会导致冠状动脉 TGFβ和TNFα表达大幅度上升，是大强度运动训练引起冠状动脉产生机体组织异常的重要生物学因素。

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Effects of Exercises Training Intensity on Expression of TGFβ and TNFα in the Rats Coronary

WU Xiaojie , etal.
(Department of Physical EducationShaanxi Normal University, Xi`an, Shaanxi, 710062)

Objective： To discuss the effect of different exercise intensity on expression of TGFβ and TNFα in the rat coronary. Method Use treadmill exercise to establish the models of aerobic exercised dandy fatigue exercise rats. We utilize immunohisto- chemistry of SABC to measure different exercise intensity to rat coronary TGFβ and TNFα expression. Result： Comparing between aerobic training group and control group, the MOD of TGFβ in coronary expression decreased but has no difference in three groups. The MOD of TNFα expression was significant. The fatigue group coronary TGFβ and TNFα expression compare with the control group and aerobic group were significant. Conclusion： Expression change of rats coronary TGFβ and TNFα was caused by exercise training also had a closed relation with the exercise intensity. Moderate expression of coronary TGFβ and TNFα could be caused by aerobic exercise, and the fatigue training could cause the rats coronary TGFβ and TNFα excessive expression. Therefore we believed that the exercise training causes the TGFβ and TNFα expression change.

exercise training；coronary；rat；TGFβ；TNFα；immunohistochemisty

吴晓杰（1985—），男，山西临汾人，在读硕士，研究方向：运动医学。