碱性蛋白酶水解蚕豆蛋白的条件优化

白小佳，宋庆明，肖萍，王艳萍

（天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

碱性蛋白酶水解蚕豆蛋白的条件优化

白小佳，宋庆明，肖萍，王艳萍*

（天津市食品营养与安全重点实验室，天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

采用碱性蛋白酶酶解蚕豆分离蛋白，通过正交试验确定最佳酶解反应条件：反应温度为50℃，pH值为8.5，酶与底物比为16000 U/g，底物浓度为60 g/L。在此条件下，水解度可以达到15.55%。

蚕豆蛋白；酶解；优化

近年来多肽越来越受到重视，现代生物学试验已经证明，多肽与蛋白质和氨基酸相比具有更多的优点：多肽在肠道中的吸收率最好[1]，一些低肽如二肽、三肽的吸收速度比氨基酸快；一些多肽具有强化机体免疫、促进人体新陈代谢的作用；多肽具有低抗原性、促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质吸收、降血压、抗氧化、促进微生物生长等生理功能；多肽具有较好的酸、热稳定性、水溶性[2]。这些功能使蛋白质的分解产物作为高效氮源受到国际营养界和食品产业的高度重视。乳蛋白的分解物、大豆蛋白的分解产物、畜血蛋白的分解产物和玉米蛋白的分解产物都已经成为运动饮料、功能食品和医疗食品的重要原料。

蚕豆的蛋白质含量高,是我国重要的粮食、蔬菜和副食品。蚕豆的微量元素含量较高,尤其是磷、镁、硒的含量居常食几种豆类之首,成熟的蚕豆中B族维生素的含量比其他豆类都高，而未成熟蚕豆则是VA和VC的上等来源。蚕豆种子不仅蛋白质含量高。而且蛋白质中氨基酸种类全，人体内不能合成的8种必需氨基酸中，除色氨酸和蛋氨酸含量稍低外，其余6种含量都高，尤其以赖氨酸含量丰富，比谷物中高出3倍，所以蚕豆被誉为植物蛋白质的新来源[3]。因此，许多国家都很重视对蚕豆的研究，并对相应发展起来的蚕豆加工业也加倍关注。

本课题组已经对蚕豆蛋白的超声提取工艺进行了研究，取得了较好的效果[4]。本试验通过对碱性蛋白酶酶解蚕豆蛋白的条件进行优化，制取蚕豆蛋白水解产物，提高了蚕豆的营养价值，为今后对蚕豆蛋白水解物生物活性的研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

蚕豆：购于天津北塘市场。

1.1.2 试剂

碱性蛋白酶：天津市诺奥科技发展有限公司（2×105U/g）；其它试剂均为分析纯。

1.1.3 仪器

DELTA-320型pH计：瑞士METTLER TOLEDO公司；78HW-1型恒温磁力搅拌器：杭州仪表电机厂；VIS-7220型分光光度计：北京瑞利分析仪器公司；LRH-250生化培养箱：天津市达北实验仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 蚕豆分离蛋白的制备流程

市售蚕豆，50℃～60℃水溶涨24 h,去皮后,将蚕豆置于55℃烘箱中烘干，所得蚕豆仁用粉碎机粉碎后过60目筛，得到的蚕豆粉置于4℃冰箱中储存备用。经超声提取蚕豆粉中蛋白质，调pH至4.2，离心保留沉淀，冷冻干燥24 h，得到蚕豆分离蛋白[4]。

1.2.2 蛋白质含量的测定

凯氏定氮法，参照GB5009.5-1985《食品中蛋白质的测定方法》[5]。

1.2.3 水解度（DH）的测定

蛋白水解度（DH）以水解断裂的肽键数目（h）占总肽键数目（htot）的百分数来表示，即DH=h/htot×100%，由于pH-stat法[6]具有操作简单，连续测定的优点，因此主要采用该法来检测蚕豆分离蛋白的水解度。

蛋白水解度可根据水解过程中NaOH的消耗量来进行计算，计算公式如下：

式中：B为水解过程中所消耗的NaOH的溶液量，mL；NB为-溶液的当量浓度，（mol/L）；α 为水解时 α-氨基平均解离度，1/α=1+10（pK-pH）；pK 为蛋白质 α-氨基的pK值；pH为水解溶液的pH值；MP为底物蛋白质的总量，g；Htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，Htot取 7.75 mmol/L[7]。

1.2.4 蚕豆分离蛋白的酶解反应

准确称取适量蚕豆分离蛋白于100 mL蒸馏水中混匀，放入集热式磁力搅拌器中，调节温度、pH值，加入一定量蛋白酶进行水解，通过加入2 mol/L氢氧化钠来保持pH值不变，记录碱液消耗量，换算成DH值，反应时间 1 h（pH变动范围 ±0.1），到达时间后，调节溶液pH值到4.0，并在85℃水浴中维持20 min，对酶进行灭活，然后迅速冷却至室温，在4000 r/min下离心20 min，倾倒出上清液，调pH到7.0，冻干备用。

记录NaOH溶液的滴加量，利用公式（1）pH-stat法计算水解度。

1.2.5 温度对水解反应的影响

精确称取6 g蚕豆分离蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，加入 84000 U 碱性蛋白酶，分别在 40、50、60、70 ℃温度，pH值为8.0的条件下进行水解反应，记录消耗的氢氧化钠的体积，研究温度对水解的影响。

1.2.6 pH对水解反应的影响

精确称取6 g蚕豆分离蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，加入84000 U碱性蛋白酶，反应温度为60℃，分别在 pH 为 8.0、8.5、9.0、10.0的条件下进行水解反应，记录消耗的氢氧化钠的体积，研究pH对水解的影响。

1.2.7 底物浓度对水解反应的影响

分别精确称取 4、5 、6、7、8、9 g 的蚕豆分离蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，加入84000 U碱性蛋白酶，反应温度为60℃，pH为8.0条件下进行水解反应，记录消耗的氢氧化钠的体积，研究底物浓度对水解的影响。

1.2.8 酶与底物浓度比对水解反应的影响

分别精确称取6 g蚕豆分离蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，分别加入 60000、72000、84000、96000 U 碱性蛋白酶，使酶与底物浓度比为10000、12000、14000、16000 U/g，反应温度为60℃，pH为8.0条件下进行水解反应，记录消耗的氢氧化钠的体积，研究酶与底物浓度比对水解的影响。

1.2.9 酶解条件的优化

正交试验[8-9]具有试验次数少、代表性强和综合可比的优点。根据酶解的单因素试验结果，选择温度、底物浓度、pH值、酶与底物比为正交试验的因素，拟通过L16（45）正交试验来确定最佳水解反应条件，以DH为指标，确定蚕豆分离蛋白最佳水解工艺参数，表1为正交试验因素水平编码表。

表1 L16（45）正交试验因素水平设计表Table1 Factorsandlevelsdesignoforthogonaltest

2 结果与分析

2.1 蚕豆分离蛋白的提取

将蚕豆粉按照1∶12的料液比溶于蒸馏水中，调节pH到8.0，功率660 W下超声提取20 min，2000 r/min离心5 min，取上清液，调节pH到4.2，沉淀蚕豆蛋白，3500 r/min离心10 min，取沉淀，冷冻干燥24 h，得到蚕豆分离蛋白，此条件下提取的蚕豆分离蛋白中蛋白质含量为89.32%。

2.2 反应温度对水解的影响

各种催化反应都有最适的温度，此时，酶的反应速度最快。与普通化学反应一致，在酶的最适温度以下，随着温度的升高，反应物能量增加，单位时间内分子间有效接触次数增加，反应速度越快。如果反应体系温度超过酶的最适温度，酶分子吸收了过多的能量，引起维持酶分子结构的次级键解体，导致变性，因而使酶活性减弱甚至丧失催化能力。

图1可知，在温度<60℃时，随温度升高DH增大；当温度为60℃时，DH达到最大值；但温度>60℃时，DH随温度增加而降低，因此，本试验条件下，碱性蛋白酶水解蚕豆分离蛋白的最适温度60℃。

2.3 反应pH对水解的影响

酶分子是一种特殊的蛋白质分子，具有一个或若干个活性部位，酶的活性部位由结合部位和催化部位组成。结合部位的功能是直接与底物相结合，而催化部位则催化底物进行特定的反应。活性部位中的基团在蛋白质的一级结构所处的位置通常相距较远，也许可能位于不同的肽链上，但是它们在酶的空间结构却必须按一定的相对位置靠近在一起，形成活化中心（活性部位）。因此酶的活性部位只有在酶蛋白保持一定的空间构象时才能存在，并发挥其催化作用。结合部位和催化部位的基团对反应体系的pH值变化比较敏感，其解离状态随pH的变化而变化，这些变化影响了酶分子的特殊构象。另外体系中作为底物的蚕豆分离蛋白随着pH值变化也表现出不同的解离状态，因此，pH值直接影响了酶与底物的结合和催化，是酶催化反应的主要因素之一。反应pH对水解的影响见图2。

由图2可知，在pH小于8.5时，随pH升高，DH升高；在pH大于8.5时，随pH升高而DH降低；而在pH为8.5时，DH达到最大。本反应体系下，碱性蛋白酶催化蚕豆分离蛋白水解的最适pH值为8.5。

2.4 底物浓度对水解反应的影响

酶与底物反应速度在一定程度上取决于底物浓度，由图3可知，DH随底物浓度的增大而呈下降趋势。

底物浓度在不断受热情况下，蚕豆蛋白分子易于产生交链聚合现象。使酶分子与蛋白分子之间的接触机会减少，从而导致DH的下降，且溶解性差，黏度增大，影响反应速度。但底物浓度过低时，产品的得率和生产效率不高，经济效益差。综合考虑，选用底物浓度为60 g/L作为最适底物浓度。

2.5 酶与底物浓度比对水解的影响

在底物蚕豆分离蛋白浓度一定时，底物的转化率取决于酶浓度，酶浓度越大，酶与蛋白质分子肽链接触几率增加，底物转化为产物可溶性肽也就相应地增加。所以高剂量的酶可提高转化率，但酶成本较高，适当添加可降低成本。综合考虑，水解反应速率、蛋白质水解度及生产成本之间的相互作用，确定一个最佳酶用量，以达到低成本高效率，同时又能达到目标水解度的要求。酶与底物浓度的对水解的影响见图4，由图4结果可知，随着酶与底物浓度比的增加，DH增加。但16000 U/g与14000 U/g相比，DH相差不大，酶与底物浓度比无需再增加。

2.6 酶解条件的优化分析

按照1.2.9的方法进行正交试验，结果如表2所示。

表2 L16（45）正交试验设计表及试验结果分析Table2 L16（45）Orthogonalexperimentaldesignandresult

根据各因子3个水平极差大小得出对水解度影响的主次顺序为：温度>底物浓度>酶与底物浓度比>pH。碱性蛋白酶水解蚕豆分离蛋白的最佳条件为：温度为50℃，pH值为8.5，酶与底物比为16000 U/g，底物浓度为60 g/L，水解度达到15.55%。

3 结论

以水解度为指标，使用碱性蛋白酶水解蚕豆分离蛋白，根据单因素试验结果，做正交试验得出碱性蛋白酶水解蚕豆分离蛋白的最佳工艺条件为：反应温度为50℃，pH值为8.5，酶与底物比为16000 U/g，底物浓度为60 g/L，水解度达到15.55%。可利用该蚕豆蛋白水解物为原料开发多种产品，具有较好的应用前景。

[1]陈雪梅，严丹红，农向，等.牛乳源活性肽及其研究进展[J].西南民族大学学报，2006，32(2)：226-229

[2]高福成.食品分离重组工程技术[M].北京：中国轻工业出版社，1998：95-802

[3]孙远明.食品营养学[M].北京：科学出版社，2006：103-105

[4]王艳萍，李双喜，程巧玲.超声提取蚕豆蛋白的研究[J].食品研究与开发，2008,29(5)：71-72

[5]中华人民共和国卫生部.GB5009.5-1985食品中蛋白质的测定方法[S].1985

[6]Magdalena Karama,Ryszard Amarowice,Henryk Kostyra.Effect of Temperature and Enzyme Substrate Ratio on the Hydrolysis of Pea Protein Isolates by Trypsin[J].Czeeh J.Food Sci.,2002(20)：1-6

[7]Adler-Nissen Jens.Enzymatic hydrolysis of food proteins[M].London:Elsevier applied science publishers,1986:12-14

[8]北京大学数学力学系数学专业概率统计组.正交设计[M].北京：人民教育出版社，1976：85-89

[9]彭志英.食品酶学导论[M].北京：中国轻工业出版社，2002：162-163

Optimizing Hydrolysis Conditions of Broad Bean Protein by Alkaline Protease

BAI Xiao-jia,SONG Qing-ming，XIAO Ping,WANG Yan-ping*
（Tianjin Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Faculty of Food Engineering and Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China）

Alkaline protease hydrolysis of broad bean protein was investigated in this research.The result indicated that the hydrolysis degree was 15.55%under the optimized conditions of the hydrolysis temperature 50℃,the solution pH 8.5,enzyme and substrate ratio 16000 U/g,and the substrate concentration 60 g/L.

Broad bean protein;hydrolysis;optimization

白小佳（1975—），女（汉），副教授，博士，研究方向：食品生物技术。

*通讯作者

2009-09-04