小麦粉中偶氮甲酰胺的高效液相色谱法快速测定

周漪波，黄芳，朱志鑫，邓欣

（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070）

小麦粉中偶氮甲酰胺的高效液相色谱法快速测定

周漪波，黄芳，朱志鑫，邓欣

（中国广州分析测试中心广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070）

建立用高效液相色谱（HPLC）测定小麦粉中的偶氮甲酰胺的测定方法。样品经丙酮超声振荡提取，高效液相色谱分离，紫外检测器定性定量。试验优化样品提取方法和色谱条件，色谱柱为Kromasil C18，5 μm，4.6 mm×250 mm；流动相A为10 mmol/L H2SO4水溶液和甲醇，采用梯度洗脱，进样量5 μL;检测波长245 nm；流速0.8 mL/min。相对标准偏差小于7.6，回收率在85%～87%之间，检出限为1.0 mg/kg远低于国家标准45 mg/kg的限量规定。本方法简单快捷，已应用于小麦粉中ADA的快速测定。

小麦粉；偶氮甲酰胺；高效液相

偶氮甲酰胺（Azodicarbonamide），简称 ADA，分子式为C2H4N2O4，分子量为116，为黄色至橘红色结晶性粉末，具有在低用量下实现安全快速氧化的效能，能改善面团的物理操作性质和高筋力面团所需的组织结构，适用于做小麦粉处理剂和焙烤食品的快速发酵剂[1-2]，是溴酸钾的理想替代产品，在国内外已获得广泛应用，并已通过WHO和FDA的批准。

由于偶氮甲酰胺属于碱性物质，如果在食品中超量使用，可能会对人体的肠胃和肝脏造成损害。ADA在高温下分解产生气体发泡，同时会生成有毒物质盐酸氨基脲（SEM）[3-5]，欧盟于2004年1月6日发布了2004/1/EC指令，暂停ADA作为发泡剂在食品中的使用，我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760-2007）规定其在小麦粉中的最大使用量为45 mg/kg。虽然我国和欧盟都限制了ADA的使用，但并没有制定相应检测标准，甚至连关于ADA的检测方法方面的研究也鲜于报道。

采用高效液相色谱（HPLC）技术，建立了小麦粉中ADA的快速检测方法，并对不同的前处理方法和色谱条件进行了优化。结果表明：该方法样品处理简单快速，测定结果准确可靠，检出限达到1.0 mg/kg，远低于国标的要求。本方法已成功应用于小麦粉中偶氮甲酰胺的快速测定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱（带自动进样器）配紫外检测器：美国Agilent公司；As3120超声波振荡器：Auto Science公司；TDL-40B离心机：Anke公司。

偶氮甲酰胺标准品溶液：取偶氮甲酰胺对照品（浓度大于99%），用丙酮配制成1000 mg/L标准储备液，使用时再用溶剂逐级稀释至所需浓度。标准储备液置于冰箱内可保存1年；水为去离子水；乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、二甲基亚砜均为分析纯：广州化学试剂厂；滤膜（0.45 μm，有机相）。

1.2 样品处理方法

准确称取面粉约1 g（精确到0.001 g）于10 mL容量瓶中，加入丙酮8 mL，超声振荡10 min，加入丙酮定容至10 mL，4000 r/min离心15 min，取上清液2 mL通过有机相滤膜并装于进样瓶，待上机分析。

1.3 液相色谱条件

色谱柱：Kromasil C18，5 μm，4.6×250 mm；流动相：A为10 mmol/L H2SO4水溶液，B为甲醇，采用梯度洗脱，0～7 min为A 100%，7.1 min～10 min为A 0%；进样量5μL;检测波长245 nm；流速0.8 mL/min。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱条件优化

试验考察甲醇-水，甲醇-0.05%KH2PO4缓冲液，甲醇-10 mmol/L H2SO4水溶液3种不同的流动相体系，结果表明：甲醇-H2SO4水溶液体系的洗脱效果最好，加入少量H2SO4可以改善峰形，防止峰的拖尾，有利于提高分离度[6]。由于在此波长处丙酮有吸收且出峰在目标峰后面，为了尽快将溶剂及杂质赶出，采用梯度洗脱方式。

2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 不同提取溶剂提取效果的比较

由于偶氮甲酰胺极性较强，几乎不溶于水和大多数有机溶剂,微溶于二甲基亚砜，易溶于N,N-二甲基甲酰胺。比较了用丙酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺等作为提取剂的提取效果。在1.0 g小麦粉中加入50 mg/kg的ADA标准溶液1 mL，浸泡2 h后分别用丙酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺进行超声波振荡提取，按前述方法测定ADA回收率（见表1）。结果表明：以丙酮作为提取溶剂回收率最高，因此，本试验选择丙酮提取溶剂。

2.2.2 不同提取溶剂提取效果的干扰效果比较

图1为采用丙酮作为提取溶剂提取的HPLC色谱图。

表1 丙酮、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺提取效果对比Table1 Comparisonoftheextractionrateofacetone,dimethyl sulfoxideandN,N-dimethylformamide

由图1可以看出，丙酮提取的HPLC图干扰物少，易于定量，这是由于小麦粉中脂溶性的干扰物质很少，水溶性杂质较多，以丙酮作为提取溶剂，可以达到减小干扰的目的。所以选用丙酮作为提取溶剂。

2.3 提取方式和时间的选择

2.3.1 提取方式的选择

考察了索氏提取与超声波两种不同提取方法对ADA提取效果的影响，发现二者效果相差甚微，且均能达到定量回收要求。考虑到索氏提取耗时长溶剂消耗大，超声波振荡提取方法能够达到提取完全的要求，固采用超声波振荡法提取。

2.3.2 提取时间的选择

以加标50 mg/kg的面粉为研究对象，分别超声提取5、10、15 min提取2次，经比较，以上不同样品提取时间测得偶氮甲酰胺的检测浓度分别为：39.5、43.2、43.3 mg/kg。试验结果表明，以丙酮作为萃取溶剂进行超声振荡提取10 min后其回收率就可达86.4%，且延长时间也不能对提取率有明显的提高。

综上所述，确定样品的前处理条件为2.2节所述。由于采用了HPLC法可以达到理想分离效果，故样品提取后无需净化即可直接上机分析，简便快速，回收率较高。

2.4 线性范围、线性方程、检出限

取ADA标准储备液逐级稀释成1.0、10、50、100和500 mg/L系列标准溶液，以色谱法面积（A）和质量浓度（ρ mg/L）做工作曲线，线性方程为 A=2.87ρ-3.27，r=0.9998，在1.0 mg/L～500 mg/L浓度范围内线性关系良好，以取样量1.0 g计，本法对样品的检出限为1.0 mg/kg，远低于国标规定的45 mg/kg的限量，可满足小麦粉中ADA测定的要求。

2.5 方法的回收率和精密度

取不含ADA的小麦粉样品，分别加入3种不同水平的ADA标准溶液，浸泡2 h以上后测定ADA的回收率，每个样品平行测定5次，结果见表2。

表2 样品中ADA测定的回收率及相对标准偏差Table2 RecoveryandRSDofADAinthesamples

由表2可知，样品中ADA的回收率在85%～87%之间，相对标准偏差在3.2%～7.6%之间。

2.6 实际样品的测定

应用本方法测定了20批次市售小麦粉中的ADA，多数样品未检出ADA，只有2个样品检出含有ADA（市售样品检出ADA色谱图见图2），而且其含量都低于0.045 g/kg。

3 结论

本文建立了用高效液相色谱（HPLC）测定小麦粉中的偶氮甲酰胺的方法，方法简单快捷，灵敏度高，已应用于小麦粉中ADA的测定。

[1]王远成，任凌云，张鹏涛.偶氮甲酰胺对面粉粉质及面包质量的影响[J].中国粮油学报,2001,16(2):32-35

[2]王远成.一种新型面粉改质剂-偶氮甲酰胺[J].陕西粮油学报,1994,19(2):21

[3]Cooper K A,Samsonova J V,Plumpton L，et al.Enzyme immunoassay for semicarbazide-the nitrofuran metabolite and food contaminant[J].Analytical Chimica Acta,2007,502(1):64-71

[4]Noonan G O,Begley T H,Diachenko G W.Semicarbazide formation in flour and bread[J].Journal of Agricultual and Food Chemistry,2008,56(6):2064-2067

[5]Becalski A,Lau B P Y,Lewis D，et al.Semicarbazide formation in azodicarbonamide-treated flour:A model study[J].Journal of Agricultual and Food Chemistry,2004,52(18):5730-5734

[6]李发美.医药高效液相色谱技术[M].北京:人民卫生出版社,1998:50-52

Rapid Determination of Azodicarbonamide in Wheat Flour Using High-performance Liquid Chromatography

ZHOU Yi-bo,HUANG Fang,ZHU Zhi-xin,DENG Xin
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for dangerous Chemical，China National Analytical Center，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

A method was established for the determination of azodicarbonamide （ADA）in wheat using high performance liquid chromatography（HPLC）.ADA in wheat was extracted by sonication with acetone,separated by HPLC,then qualitative and quantitative assessment using ultraviolet detector（UVD）.The conditions of extractionwereoptimized.Theoptimizedchromatographyconditionswere:KromasilC18column（250mm×4.6mm，5 μm）with methanol and 10 mmol/L sulphuric acid water solution as the mobile phase at a flow rate of 0.8 mL/min.The recovery of ADA was in the range of 85%-87%and the RSD was less than 7.6%.The limit of detection was 1.0 mg/kg.The method was proved to be simple and accurate,and has been applied to the determination of ADA in wheat.

wheat；azodicarbonamide;HPLC

周漪波（1981—），男（汉），助理工程师，学士，主要从事食品安全方面的研究。

2009-08-03