不同家系马尾松插穗内源生根抑制物的分离、纯化及鉴定

李永进，丁贵杰

（1.贵州大学 造林生态研究所，贵州 贵阳 550025；2.湖南省林业科学院，湖南 长沙 410004）

马尾松Pinus massoniana是中国特有的最重要的乡土工业用材林树种之一，在森林资源发展中，具有十分重要的地位。它具有分布广，适应性强，耐干旱贫瘠，速生丰产，用途广泛，纤维优良和全树综合利用程度高等特点［1］。20世纪90年代以来，一些学者对马尾松扦插繁殖技术进行了研究［2－6］，取得了较大突破，对马尾松内源抑制物也有一些研究报道［7－8］，但未见有从家系水平探讨马尾松内源抑制物的文献报道。笔者借鉴国内有关内源抑制物的研究经验［9－11］，选取5个家系马尾松插穗进行内源抑制物的测定分析，希冀通过对其内源抑制物质的分析来揭示不同家系马尾松插穗难生根的原因，为提高马尾松插穗生根率，推动无性繁殖及改良工作提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 插穗的来源

插穗采自重庆亚克公司马尾松采穗圃。以2年生的5个家系（Z364，Z505，Z190，Z258，Z235）作为采穗母株，选取当年生半木质化，生长健壮，10 cm左右的萌条作为穗条。

1.2 内源抑制物质的提取和纯化

材料的处理方法见参考文献［7］，并按图1所示流程对内源抑制物质进行分离、纯化，制备得到5个家系插穗内源抑制物质提取液。

1.3 提取分离物的活性测定

先把提取得到的Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ等4种乙醚提取物，分别浓缩定容至100 mL。在培养皿中放入滤纸，分别加入Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ等4种乙醚提取物1.0 mL，待乙醚完全挥发后，加入蒸馏水10 mL·皿－1，用白菜Brassica chinensis种子进行活性鉴定，蒸馏水做对照。在培养箱内，28℃条件下黑暗中培养24 h。24 h后测定白菜种子发芽率，48 h后测定幼根长度。试验重复3次。

1.4 纸层析、化学鉴定及生物鉴定

内源抑制物成分的纸层析、化学鉴定及以白菜为材料进行生物鉴定的方法均见参考文献［7］。另外，进行纸层析时，同时用内源抑制物提取液进行脱落酸标准品的纸层析，用正丁醇 ∶乙酸乙酯 ∶乙醇（4∶5∶1）为溶剂，对脱落酸标准品和提取物Ⅲ进行纸层析。

1.5 仪器分析

高效液相色谱仪（Agilent 1100，美国Agilent公司）分析条件为490紫外检测器，Zorbax Eclipse XDBC18 柱（4.6 mm × 150.0 mm；5 μm），流动相为 15.0 g·kg－1醋酸 ∶甲醇＝30 ∶70，流速为 1.0 mL·min－1，压力为2 000 Pa，柱温为 25℃，检测波长为 260 nm，灵敏度0.2，进样量均为10 μL·次－1。

各类插穗内源抑制物经高效液相色谱法（HPLC）分离提纯，得单一吸收峰的组分，从各组分中吸取10 μL，使各对应组分混和检查是否仍为单一吸收峰。

用紫外/可见光光度计（UT-1800，中国北京普析通用仪器有限责任公司）检测分离物各组分200～300 nm波长范围的紫外光谱图。

1.6 扦插试验

取上述5个家系插穗各40个，按随机区组设计，50个插穗·小区－1，共4个重复，按4 cm×5 cm的密度扦插；3个月后调查其生根率。

1.7 数据处理

采用高效液相色谱法（HPLC）自动积分仪法，得内源抑制物每个吸收峰面积。

图1 马尾松插穗内源抑制物质的分离纯化流程Figure 1 Isolation and purification flow of endogenous inhibitor contents in Pinus massoniana cuttings

2 结果与分析

2.1 4种乙醚提取分离物质的活性比较

从表1可以看出，5个家系插穗中存在着活性较高的内源抑制物。提取物Ⅰ，提取物Ⅱ，提取物Ⅲ，提取物Ⅳ等4种乙醚提取物的抑制活性差别较大，提取物Ⅲ和提取物Ⅳ的抑制活性最强，两者对白菜幼根生长的抑制活性明显高于对白菜种子萌发的抑制活性，且提取物Ⅳ对白菜种子萌发的抑制活性最强，用其处理的白菜种子发芽率仅为对照的14%。提取物Ⅰ和提取物Ⅱ对白菜种子萌发、幼根生长抑制作用较小。

表1 乙醚提取分离物的抑制活性Table 1 Inhibiting activity of the outlier adjusted with ether

2.2 内源抑制物提取液的纸层析与成分鉴定

内源抑制物提取液在以异丙醇 ∶氨水 ∶水（8∶1∶1）为溶剂进行纸层析后，发现内源抑制物提取液在滤纸上的移动速度（Rf）存在差异。经10.0 g·kg－1三氯化铁乙醇溶液鉴定，发现在Rf＝0～0.50区段有3个分离不明显的棕褐色斑点，说明抑制物内含有苯酚类。经10.0 g·kg－1三氯化铝乙醇溶液鉴定，发现在Rf＝0～0.35区段有2个分离不明显的弱荧光斑，在Rf＝0.35～0.50区段有一个强荧光斑，表明其中有黄酮类。同时发现在紫外光下分离物层析纸上Rf＝0.70处和脱落酸标准品Rf＝0.70处，都有荧光出现，只是脱落酸标准品的荧光斑大；另外，脱落酸标准品和提取物Ⅲ在以环己烷 ∶乙酸乙酯（7∶3）为溶剂纸层析后，发现两者的Rf值同为0.60，由此推断分离物中可能含有脱落酸类物质。

结果还发现，各种插穗的内源抑制物斑点位置相同，但斑点颜色的深浅有差异，表明各家系插穗的内源抑制物种类相同但含量存在差异。另外，乙醚萃取残余液纸层析分离后，进行生物鉴定表明，萃取残余液中的有些成分对白菜种子的萌发和幼根的生长也有抑制作用。由此推测，马尾松插穗中可能存在着两大类内源抑制物质：一类水溶性较强，另一类则易溶于乙醚等非极性溶剂。

2.3 内源抑制物的HPLC分离与鉴定

2.3.1 分离提纯和初步定性 内源抑制物经HPLC分离，均产生7个吸收峰（图2）。这与纸层析每组分均产生7个斑点相吻合，进一步确证内源抑制物由 7种成分（MI1，MI2，MI3，MI4，MI5，MI6和 MI7）组成。将各类插穗的内源抑制物各对应组分混合，即MI1与MI1相混合，MI2与MI2相混合，……，各混合液经HPLC分离，发现混合物仍为单一吸收峰，进一步确证各家系马尾松插穗的内源抑制物组分完全相同，不同之处仅在于浓度上的差异。由此可以推测，内源抑制物的表达受遗传基因控制，环境因子影响其表达程度［9］。在确证各类插穗内源抑制物相同的前提下，仅须检测其中一个家系内源抑制物的紫外光谱图。结果发现 MI1，MI2，MI3，MI4，MI5，MI6和 MI7分别在 228，215，253，262，274，286和234 nm有最大吸收峰。据内源抑制物 7组分的纸层析Rf值及苯酚类和黄酮类的紫外吸收峰波长，进一步确证了MI1，MI2和MI7为苯酚类，MI3，MI5和MI6为黄酮类，而MI4为脱落酸类。

2.3.2 内源抑制物组分相对含量比较 由图2可以看出，5种家系插穗的内源抑制物对应组分吸收峰的高度存在着差异。根据HPLC自动积分仪所得峰面积，计算各对应组分相对含量相对比较值（表2）。从表2中可以看出，5个家系的内源抑制物各组分总相对含量，以Z364为最高，Z235为最低；不同家系间，插穗内源抑制物各组分相对含量差异较大，其中以MI4相差最悬殊，Z364插穗的MI4相对含量值为最高，达57.79%，而Z505插穗的MI4相对含量较低，仅为7.79%。对内源抑制物各组分在5个家系间的含量进行方差分析表明，内源抑制物各组分在5个家系插穗中的相对含量存在显著差异（P=0.032 9＜0.05）。

图2 不同家系母株插穗内源抑制物的HPLC图谱Figure 2 HPLC figures of endogenous inhibitor in cuttings from five Pinus massoniana lines

表2 不同家系马尾松母株插穗内源抑制物质对应组分相对含量比较Table 2 Comparison of the relative content of endogenous inhibitor in cuttings from five Pinus massoniana lines

2.3.3 内源抑制物的生物鉴定 用白菜种子萌发和幼根的生长对内源抑制物提取液进行生物鉴定。结果表明（表3）：MI3，MI4，MI6，MI5，MI7共5种组分的抑制程度较大，其中MI6和MI7抑制程度最大，而Z364各个组分整体抑制程度都大于其他家系，说明内源抑制物在一定程度上抑制了白菜种子的萌发和幼根的生长。对5个家系插穗内的内源抑制物各组分对白菜幼根生长的影响进行方差分析表明，内源抑制物各组分对白菜幼根生长的影响存在极显著差异（P=0.000 1＜0.01），而在5个家系之间，插穗内内源抑制物的同一组分对白菜幼根生长的影响无显著性差异（P=0.088 1＞0.05）。

2.3.4 扦插成活率的验证 据5个马尾松插穗扦插生根率调查结果发现，在5个马尾松家系之间，其扦插生根率存在较大差异，5个家系的生根率分别为49.5%，74.5%，70.0%，53.0%和84.5%；对其生根率与内源抑制物各组分相对含量进行相关性分析表明（表4），马尾松扦插成活率与MI2和MI3呈极显著负相关，与内源抑制物总量、MI1呈显著负相关，与MI4，MI5和MI7存在负相关，与MI6存在正相关，但相关性并不明显。因此，阻遏内源抑制物基因表达或采取其他措施降低内源抑制物含量，将是提高马尾松扦插成活率的一个关键措施。

表3 内源抑制物各组分对白菜幼根生长的影响Table 3 Influence of endogenous inhibitor in cutting on the Brassica chinensis radical

表4 5个家系插穗生根率与内源抑制物各组分相对含量间的相关性分析Table 4 Correlation between the relative content of endogenous inhibitor and the rooting rate of 5 Pinus massoniana lines

3 结论

马尾松插穗生根率低的内部因素之一是插穗中存在活性较高的7种内源抑制物质，它们为黄酮类、苯酚类和脱落酸类物质；MI1，MI2和MI7为苯酚类，MI3，MI5和MI6为黄酮类，而MI4为脱落酸类。季孔庶等［7－8］研究发现，内源抑制物属黄酮类和苯酚类，而没发现脱落酸类，笔者再次进行本研究的重复实验，仍检测出脱落酸类的存在，这种差异可能由于提取路线、采穗季节的不同造成的，这方面原因需要进一步探讨。

5个家系插穗内源抑制物质对应组分的相同性，表明其插穗内源抑制物质受遗传基因的控制。内源抑制物各组分在5个家系插穗内的相对含量存在显著差异，且内源抑制物各组分对白菜幼根生长的抑制程度存在极显著差异；在5个家系之间，插穗内内源抑制物的同一组分对白菜幼根生长的抑制程度无显著差异。对内源抑制物对各组分相对含量与生根率之间的相关性分析可知，除MI6外，马尾松插穗内的内源抑制物各组分与扦插生根率均呈负相关。另外，对分离物和乙醚萃取残余液进行生物鉴定表明，内源抑制物质大致可分为2类：一类易溶于水的，另一类易溶于乙醚等非极性溶剂。

［1］丁贵杰，周志春，王章荣，等.马尾松纸浆用材林培育与利用［M］.北京：中国林业出版社，2006.

［2］秦国锋.马尾松嫩枝扦插繁殖［J］.林业科学研究，1994，7（1）：96－103.QIN Guofeng.Softwood cutting of Pinus massoniana［J］.For Res，1994，7（1）：96－103.

［3］余能健，游为贵，陈明武，等.马尾松扦插繁殖技术的研究［J］.福建林学院学报，1992，12（1）：19－25.YU Nengjian，YOU Weigui，CHEN Mingwu，et al.Study of cutting propagation techniques for Pinus massoniana［J］.J Fujian Coll For，1992，12（1）：19－25.

［4］季孔庶，王章荣，陈天华，等.马尾松扦插繁殖年龄效应及继代扦插后复壮效果［J］.浙江林学院学报，1999，16（4）：341－345.JI Kongshu，WANG Zhangrong，CHEN Tianhua，et al.Cyclophysis and effect of rejuvenation with continued cuttage in Pinus massoniana cutting propagation［J］.J Zhejiang For Coll，1999，16（4）：341－345.

［5］季孔庶，王章荣，陈天华，等.几种生长调节剂对马尾松插穗促根的效应［J］.福建林学院学报，2001，21（2）：120－123.JI Kongshu，WANG Zhangrong，CHEN Tianhua，et al.Effects of root-inducing regulators in rooting of cutting from Pinus massoniana Lamb.［J］.J Fujian Coll For，2001，21（2）：120－123.

［6］季孔庶，王章荣，陈天华，等.马尾松插穗生根能力变异的研究［J］.南京林业大学学报，1998，22（3）：66－70.JI Kongshu，WANG Zhangrong，CHEN Tianhua，et al.A study on rooting ability variation of Pinus massoniana Lamb.cuttings［J］.J Nanjing For Univ，1998，22（3）：66－70.

［7］季孔庶，王章荣，陈天华，等.马尾松插穗内源抑制物质的研究［J］.林业科学，1997，33（2）：142－151.JI Kongshu，WANG Zhangrong，CHEN Tianhua，et al.Study on the endogenous inhibitors in masson pine cuttings［J］.Sci Silv Sin，1997，33（2）：142－150.

［8］季孔庶，王章荣，陈天华，等.马尾松种源与内源生根抑制物的相关性［J］.南京林业大学学报：自然科学版，2002，26（2）：24－28.JI Kongshu，WANG Zhangrong，CHEN Tianhua，et al.A study on variation of the endogenous inhibitors in Pinus massoniana cuttings［J］.J Nanjing For Univ Nat Sci Ed，2002，26（2）：24－28.

［9］赵敏，王炎，张伟.北五味种子内源抑制物质活性的消长规律［J］.东北林业大学报，1999，27（3）：44－47.ZHAO Min，WANG Yan，ZHANG Wei.The changes of activity for the inner inhibitory substances in Schisandra chinensis（Trucz.）Baill seeds［J］.J Northeast For Univ，1999，27（3）：44－47.

［10］赵敏.防风种子中内源抑制物质活性的研究［J］.中草药，2004，35（4）：441－444.ZHAO Min.Studies on intrinsic activity in seed of dried root of Saposhnikovia divaricata［J］.Chin Tradit Herbal Durg，2004，35（4）：441－444.

［11］贾彩霞，翟梅枝，宋艳枝.核桃壳内源抑制物质活性的初步研究［J］.西北林学院学报，2006，21（3）：98－100.JIA Caixia，ZHAI Meizhi，SONG Yanzhi.A preliminary study on the intrinsic inhibitor activities from walnut endocarp［J］.J Northwest For Univ，2006，21（3）：98－100.