南方红豆杉离体胚培养诱导不定芽研究

曾余力，林新春，桂仁意，张翠萍，黄丽春

（浙江农林大学 浙江省现代森林培育重点实验室，浙江 临安 311300）

南方红豆杉Taxus chinensis var.mairei属国家一级濒危保护植物之一，集材用、药用、观赏于一体，经济价值极高。由于红豆杉属Taxus植物本身特殊的生物学特性，种子在天然条件下，需要两冬一夏才能萌发并且植株生长缓慢［1］，常规育种难以保证市场的需要，故通过离体胚培养技术克服红豆杉种子难以萌发的缺点，以期加快植株生长。近年来，国内外学者对短叶红豆杉Taxus brevifolia，欧洲红豆杉Taxus baccata，杂种红豆杉Taxus×media var.hicksii，东北红豆杉Taxus cuspidata等进行了离体胚培养研究［2－3］，从不同角度证实离体胚的萌发、成苗与培养基、种子来源、培养条件等有密切关系，但对南方红豆杉离体胚培养的研究较少，仅见臧新等［4－5］对南方红豆杉离体胚萌发影响因素的研究。本研究在前人的研究基础上以南方红豆杉的成熟胚为外植体，筛选外植体灭菌途径，基本培养基、植物生长调节物质等因子对离体胚生长和分化不定芽的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料购自浙江省嵊州市常青花木场，于4℃冰箱中冷藏备用。

1.2 试验方法

1.2.1 外植体灭菌 选取均匀饱满的种子，剥去外种壳，流水冲洗12 h，置于超净工作台内，分别置于 5.0，10.0，25.0 g·L－1的次氯酸钠（NaClO）溶液中真空灭菌 5，10，15 min，无菌水分别冲洗 5遍。最后在解剖显微镜下切除胚乳挑取种胚，接入MS（Murashige and Skoog）培养基中，1个种胚·管－1，各接种100管。接种后先暗培养2 d，然后再光培养。

1.2.2 不同基本培养基与植物生长调节物质对离体胚培养的影响 试验一，挑取种胚分别接种于MS，1/2MS，1/3MS，1/4MS，WPM（woody plant medium）和 B5（Gamborg）等 6种基本培养基中，测试基本培养基的影响；试验二，以WPM为基本培养基，测试不同种类和质量浓度的植物生长调节物质的影响：噻苯隆（TDZ）为 0，0.000 1，0.001 0，0.010 0，0.100 0 mg·L－1，细胞激动素（KT），6-苄氨基腺嘌呤（6-BA），异戊烯基腺嘌呤（2iP）和玉米素（ZT）为 0，0.030 0，0.300 0，1.000 0，3.000 0，10.000 0 mg·L－1。

1.2.3 种胚萌动对离体胚培养的影响 根据种胚大小、颜色分别选取萌动（长度为0.7～0.8 cm，颜色转微黄色）和未萌动（长度为0.4～0.5 cm，颜色白色）的种胚，测试不同发育时期对胚培养的影响。以WPM为基本培养基，附加 0，0.010 0，0.100 0，1.000 0 mg·L－1的 6-BA。以上试验培养条件：温度为（25±2）℃，光照度为2 500～2 800 lx，光周期（昼/夜）16/8 h。对照组（ck）为WPM基本培养基。

1.2.4 驯化移栽 将带根的试管苗置于驯化室中，在强光（2万 lx）下练苗4周，然后取出试管苗，冲净根部培养基，将植株移至泥炭 ∶珍珠岩 ∶蛭石为1∶1∶1的人工基质中。

1.3 统计分析

以上各试验设计3个重复，各试验的结果分析均采用生物统计法将平均值及其标准误差［6］和95%的可信度进行差异显着性分析［7］。

2 结果与分析

2.1 外植体灭菌

培养28 d后调查，结果见表1。最优灭菌处理为25.0 g·L－1次氯酸钠溶液真空灭菌10 min，其污染率仅6%，出苗率达86%。试验结果表明，随次氯酸钠质量浓度升高，污染率显著降低，而灭菌时间加长也能有效降低污染。由于南方红豆杉胚乳较厚，高质量浓度次氯酸钠浸泡不会损伤到离体胚的萌发生长，各处理的萌发率为93%～98%。

2.2 不同基本培养基与植物生长调节剂对离体胚培养的影响

2.2.1 不同基本培养基对离体胚培养的影响 将南方红豆杉离体种胚接于不同基本培养基中，培养2个月后，MS培养基中的胚，叶色淡绿，茎较长较粗，但根较短无侧根，根长约2.0 cm。在不同MS质量浓度（1/3MS，1/2MS，MS）培养基的胚，随无机盐质量浓度升高，芽长增长；在1/3MS中根长最长，根数最多。可能是南方红豆杉茎伸长生长需要高质量浓度的无机盐离子，根生长则以低质量浓度无机盐离子为宜，而茎叶和根的平衡生长则需要大量元素的协调配比。对应MS培养基，WPM培养基中离体胚茎段细长，叶色深绿，并有许多侧根生成，根系好，主根长度达3.8 cm，平均根数达4.3条，是南方红豆杉胚培养的最佳基本培养基；B5培养基由于茎细弱，叶色发黄，不适于南方红豆杉的胚培养（图1～3）。

2.2.2 不同植物生长调节物质对离体胚培养的影响 将离体种胚接种于含有不同质量浓度的6-BA的培养基中，50 d调查结果如表2。与对照组相比，6-BA质量浓度递增时，离体胚抽出茎叶的长度递降，胚根长度变短甚至不萌发，胚轴上有突起发生。在6-BA 0.03 mg·L－1时，胚轴有突起形成，少数有不定芽分化；质量浓度增加至0.10 mg·L－1，不定芽数量增加；但6-BA质量浓度增高到1.00 mg·L－1时，突起变少，且突起不能分化为不定芽，并随之褐化。将离体种胚接种于含有不同质量浓度的KT

的培养基中，50 d调查结果如表3。由表3可知，0.10 mg·L－1KT的培养基中离体胚无茎叶抽出和胚根伸长，但可见丛生不定芽的分化，诱导率达30%。与6-BA相比，KT更优于不定芽的分化，但对茎叶和胚根生长的抑制较明显；当KT质量浓度升高至0.30 mg·L－1时不定芽的诱导率降低，而且随KT质量浓度的升高，对胚根发育的抑制越强；当质量浓度提高至10.00 mg·L－1时，离体胚无生长、褐化。试验发现，接种于含6-BA的培养基中的离体胚仅在胚轴上有突起产生，分化少量不定芽，而接种于含KT培养基中的离体胚在胚轴、子叶和生长点均有不定芽的分化。将离体种胚接种于含不同浓度ZT的培养基中，50 d调查结果如表4。由表4可知，ZT也能有效诱导不定芽的分化。当ZT的质量浓度在0.10～1.00 mg·L－1时，胚轴、生长点和子叶均有不定芽分化，且多为丛生芽，当ZT质量浓度为1.00 mg·L－1时诱导率高达50%，与KT不同的是，ZT对茎叶抽出抑制不明显，KT质量浓度为0.10 mg·L－1时无茎叶抽出，而ZT的质量浓度为1.00 mg·L－1时仍有茎叶抽出，但节间较短，并且有轻微水化现象；当ZT升至3.00 mg·L－1时，水化更为明显。在含不同质量浓度2ip的培养基中，2iP对不定芽的诱导较6-BA强（表5），对南方红豆杉离体胚不定芽的诱导率最高，质量浓度为0.30 mg·L－1时，诱导率高达70%，但仅有1～2个单芽·胚－1，而KT和ZT的不定芽多为丛芽。对茎叶抽出抑制效果低于6-BA，当质量浓度为3.00 mg·L－1茎叶仍有抽出，叶色较绿。添加TDZ的试验处理，都无不定芽分化。低质量浓度TDZ中试管苗生长与对照组相似，质量浓度高于0.100 0 mg·L－1，胚轴膨胀，试管苗有水化现象；当质量浓度增加到1.000 0 mg·L－1，种胚呈黄褐色愈合组织（表6）。

表1 种子表面灭菌对离体种胚培养的影响Table 1 Effect of factorial tests among various concentrations of NaClO vs.its durations on germination of excised embryos

图1 不同基本培养基对芽体生长的影响Figure 1 Effects of basal media on shoot growth of Taxus chinensis var.mairei

图2 不同基本培养基对根数的影响Figure 2 Effects of basal media on root number of Taxus chinensis var.mairei

图3 不同基本培养基对根长生长的影响Figure 3 Effect of basal media on root growth of Taxus chinensis var.mairei

表2 6-BA对种胚培养诱导不定芽分化的影响Table 2 Effect of 6-BA on induction of adventitious buds by embryo culture

表3 KT对种胚培养诱导不定芽分化的影响Table 3 Effect of KT on induction of adventitious buds by embryo culture

表4 ZT对种胚培养诱导不定芽分化的影响Table 4 Effect of ZT on induction of adventitious buds by embryo culture

2.3 种胚萌动对离体胚培养的影响

由表7可知，将萌动的种胚接种到含0.10～1.00 mg·L－16-BA的培养基上，离体胚分化出大量不定芽；而且随6-BA质量浓度增高，胚轴分化不定芽的数量呈现先升高后下降的趋势；但是将未萌动的种胚接种到相同的培养基中，仅在胚轴处产生突起，没有不定芽的分化。

表5 2iP对种胚培养诱导不定芽分化的影响Table 5 Effect of 2iP on induction of adventitious buds by embryo culture

表6 TDZ对种胚培养诱导不定芽分化的影响Table 6 Effect of TDZ on induction of adventitious buds by embryo culture

表7 种胚萌动前后对胚培养的影响Table 7 Effect of with or without breaking seed dormancy on germination of excised embryos

2.4 驯化移栽

将试管苗置于模拟自然环境中，经1个月练苗驯化后，移至混合人工基质中，成活率达到90%。

3 结论与讨论

木本植物组织培养的困难之一是建立无菌材料。在建立无菌材料时，外植体表面灭菌将影响试验成败。本研究采用25.0 g·L－1次氯酸钠溶液真空灭菌10 min，污染率仅为6%，出苗率达86%。而且由于南方红豆杉胚乳较厚，高质量浓度的次氯酸钠溶液不会伤害到内部的胚，对其萌发无影响。试验还发现南方红豆杉种胚在MS培养基上能够较好的萌发生长，萌发率在95%左右，而陈永勤等［8］曾报道红豆杉在MS培养基上的萌发较差，这与本研究结果不一致。

臧新等［5］对MS和B5等培养基进行研究，认为这几种培养基对南方红豆杉的离体胚培养影响差别不大，而我们在研究中发现不同基本培养基对离体胚培养影响较大。WPM培养基能促进根系产生和茎叶生长，是南方红豆杉离体种胚培养最适宜的基本培养基。MS培养基对南方红豆杉茎段生长亦较佳，但不利其根系的生长。B5培养基也不适于南方红豆杉的胚培养。

在不同细胞分裂素对离体种胚培养的影响试验中发现，不加细胞分裂素时试管苗生长最好，添加细胞分裂素不利于种胚的伸长生长，但可诱导不定芽的产生且不需经过愈合组织而直接分化产生不定芽，其中KT和ZT最适于南方红豆杉的不定芽诱导。对于大多数树种，诱导不定芽时，外植体需接种在细胞分裂素与生长素配比的培养基中，但在许多针叶树培养中，单独使用细胞分裂素，足以诱导不定芽发生［9－10］，这与本试验研究结果相一致。

萌动后的南方红豆杉种子具有较强的生长势和生理活性，而且此时内源激素含量高于其他时期，而未萌动的种子中发芽抑制物的含量较高［11］，抑制种子的萌发生长。南方红豆杉种胚萌动对胚培养的影响，试验得知以萌动后的种胚为外植体更容易诱导出不定芽，这可能与南方红豆杉种胚内源激素随种胚成熟度而发生变化有关。

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