诱导性多能干细胞若干关键问题的研究进展*

李家速,赵宜香综述,姚忠祥审校

(1.第三军医大学学员旅四队,重庆400038;2.第三军医大学组织胚胎学教研室,重庆400038;3.中国药科大学中药学院09453班,江苏南京211198)

2006年,Takahashi和Yamanaka[1]研究小组利用逆转录病毒将Oct3/4、Sox2、c-myc和 Klf4四个转录因子(four transcription factors,4TFs)导入小鼠已分化的成纤维母细胞,再应用小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ESc)培养条件将其去分化,重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)。iPS在形态结构、表面标志物、增殖分化和畸胎瘤形成等方面与ESc极为相似,因此,其在移植免疫排斥、干细胞治疗、组织器官再生以及法律伦理学等方面极具优势。自此以后,iPS便成为多领域的研究热点,在诱导的因子、载体安全性、效率等方面都取得了举世瞩目的成果。本文将对iPS诱导重编程的最新研究进展进行综述。

1 诱导产生iPS的必要因子

Takahashi和Yamanaka[1]研究小组证实了4TFs的组合可以诱导iPS的产生,但诱导的效率较低,安全性方面也存在风险,因此这些转录因子是否具有可替代性,是否均为必要因子等问题还有待深入研究。

Yu等[2]利用慢病毒载体介导Oct4、Sox2、Nanog和Lin28 4种转录因子,成功诱导胎儿成纤维细胞转化为具有人ESc特征的iPS;Zhou等[3]则利用腺病毒介导 Ngn3、Pdx1、M afa 3种转录因子转染成年动物的胰腺外分泌细胞,成功转化为胰岛B细胞;而Huangfu等[4]只用 Oct4、Sox2就生成了人成纤维细胞的iPS,说明Oct4、Sox2在诱导重编程的过程中是必需的。Kim等[5-6]利用单个转录因子Oct4的异位表达,即人为操纵外源基因Oct4的导入和表达,成功诱导人胎儿神经干细胞转化为iPS,证实Oct4在分子水平诱导多潜能性方面不仅是必要的而且是能够胜任的,实现了单因子诱导iPS的创举。Oct4是多能干细胞的标记物,被认为是只在多能干细胞中高水平表达的转录因子,通过外源性信号分子介导的信号转导通路,与内源性转录因子Nanog、Sox2等共同组成基因调控网络,以维持干细胞的多能性,因其作用的多样性和表达的特异性而被认为是控制干细胞多能性的决定性因素[7]。通过逆转录病毒将Oct4导入胎儿神经干细胞,嵌入鼠内细胞群,并在人ESc条件下培养,直到ESc样克隆能被机械分离和进一步增殖分化,并通过多种筛选手段证实单因子Oct4诱导产生的该iPS无论是在基因表达谱、表观遗传学特征还是在体内外的全能性上,都与人ESc非常相似。这项成果将极大地推进对重编程机制的理解和制备患者特异性多潜能干细胞的研究。

有研究通过同时利用多种因子的不同组合重编程神经干细胞的细胞模型,证实Oct4和Klf4已经足够诱导出神经干细胞的多潜能性[8]。但是由于所需外源因子个数不确定和重编程目标细胞的异质性等原因,重编程潜在的分子机制还是不完全明了。

2 低毒性或无毒性载体的使用

最早得到的iPS是经由原癌基因c-myc或其蛋白产物生成的,Klf4也牵涉致癌作用,而且是通过逆转录病毒、腺病毒及慢病毒来介导的,易导致外来因子异位表达整合入宿主细胞的基因组,存在变异、自身基因表达调节失调、移植后肿瘤形成等风险,从而阻碍其未来的临床应用。最近的研究利用DNA转座子、质粒及游离载体等,诱导成功后剔除外源性插入物,在iPS安全性方面取得了突破性进展。

Kaji等[9]以含有遗传序列DNA片段的转座子替代病毒作为多蛋白表达载体,在CAG增强子的驱动下,将串联在2A寡肽序列上的4TFs同时导入鼠和人多能性标记物高表达的成纤维细胞,成功获得iPS后又利用Cre重组酶瞬时转染系统,将外源性重组因子尤其是 c-myc切除,降低了致癌风险,极大地增强了iPS在再生医学、药物筛选和构建疾病模型等方面的应用性。此方法的优点在于载体拥有自我剪切的能力,可以在移植后被剔除,但此途径重组效率偏低,还有待进一步研究。

Soldner等[10]利用Cre重组酶在生成iPS后将外源性重组因子去除,尽管保持了iPS的可塑状态,但依旧不能避免残余插入物导致的基因突变。Woltjen等[11]采用相似的不依赖病毒的单一化转座子piggyBac表达载体,介导可诱导的特殊转录因子多西环素(doxycycline),易化导入宿主细胞基因组,产生稳定的iPS;接着他们利用具有天然属性的piggyBac系统转座酶的瞬时表达,无痕迹地去除iPS的外源性插入物即致癌基因,从而使生成的iPS更安全和高效。

由此可见,2A寡肽序列的应用不仅使得诱导所需的转录因子在单一结构上递送,而且使得外来结构的完全切除变得更加容易。这项新技术在加速重编程机制的深入研究和未来的细胞治疗方面有重大意义。倘若与micro RNA、基因标记等技术结合起来,安全效果可能会更好。

Okita等[12-13]使用两个质粒作为载体,一个质粒包含编码Oct3/4、Klf4和Sox2的cDNAs,另一个含有编码c-myc的cDNAs。前者连接在来自致病病毒的、可自行分裂的2A寡肽序列上,通过质粒反复转染小鼠胚胎成纤维细胞,经PCR筛选,可获得无功能性转基因表达的iPS,移植入裸鼠可以生成畸胎瘤,以及促成成熟嵌合体。这种在质粒介导下生成iPS的方法,对阐明重编程和全能性的潜在机制意义重大。但此法的速度较慢,效率仍然较低,至于是否适用于其他组织器官和物种还有待于进一步研究。

Jia等[14]则在已有质粒编码 POU5F1(即 OCT4)、SOX2、LIN28和NANOG的基础上,外加一个GFP报告基因的2A序列,基于PhiC31的分子内重组系统除去或退化细菌质粒主链,再将其纯化和分离,获得minicircle载体,即一种具有超螺旋结构的DNA分子,诱导多潜能性的人脂肪干细胞,从而获得无转基因的人iPS。和单纯质粒相比,由于外源性沉默机制活性的降低,此法具有更高的转染率和异位基因表达能力,因此被认为可能是iPS生成的理想策略。Yu等[15]则使用无需整合的游离载体,生成的iPS完全脱离载体和转基因序列,在增殖和分化潜能方面与人ESc十分相似。此外,选择恰当的体细胞也对诱导产生的iPS的安全性极为关键。Miura等[16]用11种途径合成了36个鼠iPS,通过形成次级神经球(secondary neurospheres)来评估畸胎瘤形成的机制。为了搞清楚这些次级神经球在体内的表现特征,将这些次级神经球移植入实验鼠大脑,并进一步解剖检测畸胎瘤的形成。来自鼠ESc的3个克隆移植入34只鼠脑后,有3只死亡,其中1只形成畸胎瘤,发病率为2.9%;来自鼠胚胎样成纤维细胞的12个iPS移植入100只鼠脑后,有33只形成大小不等的畸胎瘤,发病率为33.0%;而来自鼠尾尖成纤维细胞的11个iPS移植入55只鼠脑后,有46只形成畸胎瘤,发病率为83.6%;来自鼠肝细胞的7个iPS移植入36只鼠脑后,有13只死亡,其中 10只形成畸胎瘤,发病率为27.8%;而来自鼠胃上皮细胞的2个iPS移植入8只鼠脑内,没有观察到畸胎瘤。

上述数据显示,由不同成体细胞衍生的iPS,生成的次级神经球在形成畸胎瘤的危险性上存在很大差异。因此,选择何种体细胞来诱导产生iPS,是未来细胞治疗面临的严峻挑战之一。同时,这项研究也验证了Yamanaka[17]的随机模型认为的,大部分乃至全部的分化细胞在导入4TFs后都有诱导为iPS的潜力。此外,研究还认为c-myc逆转录病毒的使用并不影响次级神经球畸胎瘤的形成倾向,而且也没有检测到c-myc或其他转录因子在iPS或次级神经球内的复活,但对于不同畸胎瘤形成倾向的潜在机制还有待进一步的研究。

3 高效诱导产生iPS的可能机制

可能由于外源因子使得组织干细胞变形、病毒整合入特定的基因组位点以及插入的拷贝数不确定等缘故,Yamanaka研究小组及以前的诱导iPS的研究成功率只有0.067%[1]。但随着研究的深入,基因路径阻断剂、化学小分子抑制剂等的应用,在加速诱导进程、提高效率等方面发挥了重要作用。

Hong等[18]在抑制p53和缺乏逆转录病毒c-myc的条件下,转染鼠胚胎成纤维细胞,经Nanog-GFP报告基因系统进行易感性和特异性鉴定,证实为iPS,转化率提高了10%。同时证实在p53缺失背景下,可以将终末分化的T淋巴细胞去分化重编程为iPS。他们利用DNA微阵列技术(microarray),分析人和鼠的成纤维细胞中均受p53调节的34个共有基因,证明p53可以抑制细胞癌变。Aparicio和Eaves[19]则认为p53途径在正常组织体内平衡和肿瘤形成的调控方面发挥重要作用。这在一定程度上说明,上述途径虽然提高了转化率,但也增加了新形成的iPS致癌风险。Marioán等[20]认为 p53介导的DNA损伤响应限制了重编程,从而确保了新形成的iPS基因组的完整性。在敲除p53的情况下,提高转化率的同时,却面临着DNA损伤,并长期伴随着iPS形成异常以及染色体异常等风险。因此,p53对预防来自欠佳的亲本细胞的iPSDNA损伤具有重要作用。而且,只有当诱导DNA损伤的重组因子被引进后,p53途径才会被激活,因此,避开DNA损伤的细胞不可能开启p53途径,而效率低的原因可能与被编程细胞的DNA损伤有密切关系。该研究同时发现,由于端粒缩短导致的DNA损伤增强的鼠成纤维细胞(G3 Terc2/2 M EFs)不能被诱导为iPS,尽管这些野生型细胞拥有正常的增殖速率和被癌基因转染的能力,故而推测诸如缩短的端粒等可能是阻碍DNA损伤的野生型细胞被重编程的主要障碍。为了证实p53与DNA损伤的野生型细胞增殖的密切关系,在p53存在与缺失的情况下,利用Oct4、Klf4和Sox2重编程端粒缩短了的野生型细胞来检测p53的作用,经过反复诱导和比照,发现p53可能是通过限制翻译,来阻碍诱导鼠和人DNA损伤的野生型细胞形成iPS,并通过p53依赖的细胞凋亡机制清除这些细胞,而且这种效应在功能失调的端粒或外源性高比例DNA损伤的野生型细胞将会恶化。数据显示在这个过程中,p53对DNA损伤是致敏的,而且p53是通过介导多潜能性诱导阶段的欠佳细胞的凋亡来限制重编程的,因此,可以认为p53在重编程和转化这两个过程中,对损伤细胞都发挥着重要的控制作用。但是,持久抑制p53会增强基因组的不稳定性,因而会影响iPS的生成[21]。

Li等[22]证实INK4/ARF基因座的激活是iPS诱导过程中限制速率的又一障碍。通常情况下,INK4/ARF基因座是处于静默状态的,在诱导过程中被激活。研究证实,抑制INK4/ARF基因座的活性,对iPS诱导效率产生极大地正面效应,而同时抑制 p53和 INK4/ARF基因座的活性,则增强了细胞的自我更新能力,从而使体细胞的重编程变得容易[23]。

Lin等[24]利用 ALK5抑制剂SB431542和M EK抑制剂PD0325901提供的化学平台,将诱导效率提高到常规方法的100多倍。常规方法用未经处理的、编码4TFs的cDNAs转染后,形成若干颗粒状克隆,暗示其只是不完全的重编程克隆;在只有SB431542的情况下,同样观察到颗粒状克隆,数目比人ESc样克隆多几倍;而在SB431542和PD0325901组合使用的情况下,颗粒状克隆大大减少,人ESc样克隆却伴发性增加,说明此两种抑制剂的组合可引导不完全重编程克隆状态转变为完全的重编程克隆状态,从此推进整个重编程进程。此外,经此两种抑制剂处理过的cDNAs,7 d即可诱导出iPS,大大加速了重编程的动力学进程。进一步的研究还发现,一种小分子Thiazovivin与SB431542和PD0325901混合后,能大大提高iPS分离后的存活率,获得更多的重编程克隆。为了检测Thiazovivin在高效分离的同时是否对SB431542和PD0325901组合产生促进作用,利用三者混合物再次诱导,发现诱导效率提高了近200倍,并缩短了转化周期。

上述新方法的独特之处在于调整了上游的信号途径,而且能快速改进普通细胞类型的重编程,能够为非病毒、非DNA依赖的更高效率和更安全的重编程进程提供基础性平台,从而为各种各样的应用提供极其安全的人iPS。如果将前述的小分子抑制剂[24]和恰当的供体细胞类型策略[16]结合起来,效果可能会更上一层楼。

此外,蛋白质合成阻碍剂valproic acid(VPA)[25]、低氧环境[26]以及维生素C[27]同样可以提高iPS的诱导效率,此方面的研究还在深入,前景诱人。

4 小 结

目前关于iPS的研究正如火如荼的进行着,在iPS诱导的原料、效率、安全性等方面都取得了可喜的进展。此外,在iPS的全能性、临床应用等方面也收获甚大。通过四倍体囊胚注射方法证实iPS全能性的小鼠已经诞生,还有诱导产生患者特异性iPS的报道,在原材料的获取、移植免疫排斥、干细胞研究,退行性或损伤性疾病等方面优势显著。但总体而言,诱导的效率还有待提高,安全性还需改进,遗传学的稳定性及后续变化证据尚显不足,诱导极具多潜能性的耕作动物细胞(如牛、马等)的研究才刚起步(已经培养出猪源iPS系),重编程的分子调控机制目前还不是很清楚,因此,iPS应用于临床实践还为时尚早。但相信,随着研究的深入,iPS所具有的优势在自体细胞替代治疗、再生医学、发育生物学、药物开发、疾病模型等方面的临床应用前景是广阔的,必将给相关疾病的患者带来福音。

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