HLA-DQ/DP等位基因与粤籍汉族斑秃及中医证型的相关性研究

刘爱民，禤国维，陈达灿，范瑞强，孙 静

（1.河南省中医院，郑州450002；2.广东省中医院，广州510120）

斑秃（alopecia areata，AA）以突然出现局限性斑片状脱发为特征，自然发病率约为1/1 000[1]，可占皮肤科门诊新患者的2%或全部患者的1.7%[2，3]。本病虽属毛发小疾，但往往给患者造成较大的身心伤害，是皮肤科最常见的疾病之一。斑秃的病因病机尚未完全明了，目前认为遗传因素在斑秃的发病中起着重要作用[4]，国内外很早就有研究者对定位斑秃与HLA连锁的易感基因产生了极大兴趣并取得了一定结果，同时也有研究表明中医证侯和方证与HLA有着相关性。我们采用聚合酶链反应-序列特异性引物（polymerase chain reaction sequence specific primer,PCR-SSP）基因分型方法，对51名粤籍汉族斑秃患者提供的DNA标本进行HLA-DQ/DP等位基因多态性分析，并与粤籍汉族健康自愿者进行对照，以探讨其与斑秃遗传易感性及中医证型之间的关系，现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 粤籍（连续三代出生居住在广东）汉族斑秃患者51例，其中男30例，女21例，年龄5～68岁，平均（30.37±13.04）岁。均为广东省中医院皮肤科门诊初诊患者。根据诊断标准[5]分型，其中斑片型（轻型）25例，重型斑秃17例，全秃3例，普秃6例（重型）。根据中医辨证标准[6]分型，其中肝肾不足型24例，血热风燥型12例，气血两虚型7例，气滞血瘀型8例。另选取110例粤籍汉族体检健康自愿者，无斑秃家族史，其中男43例，女67例，年龄16～50岁，平均（31.4±8.24）岁。两组均无血缘关系，且年龄、性别构成比上差异无统计学意义。

1.2 样本处理 受试者肘静脉采血3mL，ACD-B抗凝，离心（1 500r/min）后用毛细管吸取白细胞层，加20mL红细胞裂解液，洗3次备用。

1.3 DNA的提取 采用德国QIAGEN公司的试剂盒。将25μLQIAGEN蛋白酶K置于1.5 mL塑料离心管，取2mL抗凝全血2 000 r/min离心10min，吸取200μL白膜层加入离心管，再加入200μL AL缓冲液，混匀 15s，56℃孵育 10 min，简单离心，然后加入200μL无水乙醇并混匀，简单离心，将上述混合液转至DNA亲和柱上，以10 000 r/min离心1min，去除滤过液，在柱上加入500μL AW1缓冲液，离心1min，去除滤过液，在柱上加入500μLAW2缓冲液，14 000r/min离心3min，然后加入AE缓冲液，室温孵育5min，最后8 000 r/min离心1min洗脱DNA，并于紫外分光光度计上测定DNA的浓度和纯度。

1.4 基因分型 采用PCR-SSP技术。

1.4.1 序列特异性引物HLA-DQA1、DQB1等位基因序列特异性引物根据1995年公布的HLA-Ⅱ类等位基因核苷酸序列[7]，参照 Olerup 等[8，9]方法设计，由北京大学附属人民医院中心实验室提供；HLADPA1序列特异性引物购自美国G&T公司，总反应体系 8μL。

1.4.2 PCR-SSP方法 序列特异性引物（SSP）只能与等位基因特异性片段的碱基序列互补性结合，通过PCR反应特异性扩增该基因片段。

1.4.3 PCR反应条件 ①DQA1、DQB1：预变性95℃ 60s，变性 95℃ 30s，退火 58℃ 30s，延伸 72℃45s，后延伸 72℃ 300s，共 35 个循环；②DPA1：95℃热启动 5min 后，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 90s，共 30个循环。以上PCR扩增产物直接点样于含溴化乙锭的2%琼脂凝胶中，在100V电压下电泳30min，紫外透射仪上观察结果并照相。根据bp片段的大小，对照marker确定等位基因。

1.5 统计学处理 基因频率根据国际常用计算公式[10]计算代表i基因频率，C代表i基因阳性个体数，N代表受检人数）。建立基因频数数据库，采用SPSS13.0软件计算χ2值、P值和RR值（相对危险度）。RR=ad/bc，式中a为受检者中某基因阳性的患者数，b为受检者中某基因阴性的患者数，c为受检者中某基因阳性的健康对照人数，d为受检者中某基因阴性的健康对照人数。

2 结果

2.1 斑秃与HLA-DQA1、HLA-DQB1等位基因的相关性 统计分析结果见表1、表2。HLA-DQA1*0201、DQA1*0601、DQB1*0501、DQB1*0602 基因频率斑秃组显著高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01），提示这四个等位基因可能是斑秃的易感基因；携带这四个基因者，其发生斑秃的危险性是正常人的2.513～9.7倍。DQB1*0301斑秃组显著低于对照组（P<0.05），提示该等位基因可能是斑秃的保护基因，缺乏该基因者，保护其免患斑秃的可能性小，仅是正常人的30.1%。按病情轻重程度分层比较发现，DQB1*0301主要与重型组相关，DQB1*0501则主要与轻型组相关。

表1 斑秃组与对照组HLA-DQA1、DAB1等位基因频率比较（n=阳性数）

表2 斑秃轻重程度与HLA-DQA1、DAB1等位基因的关联情况（n=阳性数）

2.2 斑秃与HLA-DPA1等位基因的相关性 统计分析结果见表3、表4。HLA-DPA1*0103基因频率斑秃组显著高于对照组（P=0.018，RR=2.877），提示该等位基因是斑秃的易感基因，携带该基因者发生斑秃的危险性比正常人高2.877倍；DPA1*0201斑秃组显著低于对照组（P=0.000，RR=0.093），提示该等位基因是斑秃的保护基因，缺乏该基因者，保护其免患斑秃的可能性小，仅是正常人的9.3%。经按病情轻重程度分层比较发现，DPA1*0103主要与轻型组相关（P=0.006，RR=4.427）。

表3 斑秃组与对照组HLA-DPA1等位基因频率比较（n=阳性数）

表4 斑秃轻重程度与HLA-DPA1等位基因的关联情况（n=阳性数）

2.3 斑秃中医证型与HLA-DQ/DP等位基因的相关性

通过斑秃中医证型与HLA-DQ/DP的关联性分析发现，DQA1*0301气血两虚型基因频率为0.6220，显著高于其他证型，统计学处理有显著差异（P<0.05）。其余中医证型与HLA的关联性分析均无统计学意义。见表5。

表5 斑秃患者不同中医证型与HLA-DQA1基因频率比较

3 讨论

位于人第6号染色体短臂上的HLA基因是目前公认的最复杂、最具高度多态性的遗传学标记，人们越来越多的将其应用于与遗传因素相关疾病的关联性研究。近年来，斑秃的遗传特性引起了国内外学者的广泛关注，斑秃与HLA等位基因的相关性自然成为研究其遗传发病机制的热点。本研究采用常用的PCR-SSP法，对粤籍汉族斑秃患者这一群体进行HLA基因遗传构成研究，重点探讨了HLADQ/DP等位基因与粤籍汉族斑秃及中医证型的相关性，并与国内外针对不同群体的研究结果参考印证。 本研究提示，HLA-DQA1*0201、QA1*0601、DQB1*0501、DQB1*0602、DPA1*0103 可能是斑秃的易感基因，DQB1*0301、DPA1*0201可能是斑秃的保护基因，并发现DQB1*0301主要与重型组有关，DQB1*0501、DPA1*0103则与轻型组相关。本结果与近年国外[11、12]、国内[13]的同类报告有所不同，表现了鲜明的种族和地域差异。通过斑秃中医证型与HLA-DQ/DP的关联性分析发现，DQA1*0301气血两虚型基因频率为0.6220，显著高于其他证型，统计学处理有显著差异（P<0.05），提示DQA1*0301基因与斑秃气血两虚证有内在关联，可能是气血两虚证型的易感基因，也可作为辨证时的参考。

另外，与斑秃轻重程度相关的基因与斑秃易感基因可能不具一致性，而且斑秃的发病可能并非单一基因异常，可能是多个或多组基因共同调控的结果。本研究虽得出了可能与斑秃发病关系密切的若干HLA等位基因，但仍难以明确定位最终致病基因。因此，为更准确反映HLA-DQ/DP等位基因与斑秃的关系，尚有待进一步扩大样本量，开展多地域多种族的更深入研究。

[1]王椿森，李家文，黄长征，等.皮肤性病免疫学[M].武汉：湖北科技出版社，1999：356-359.

[2]SchwartzRA,JannigerCK.Alopeciaareata[J].Cutis,1997,59:238-241.

[3]MacDonald N.Alopecia areata:identification and current treatment approaches[J].Dermatol Nurs,1999,11:356-359,363-366.

[4]陈炜.斑秃病因的研究进展[J].国外医学皮肤性病学分册，2001，27(1)：16-19.

[5]中国中西医结合学会皮肤性病学会.5种皮肤病的中西医结合诊断与疗效判定标准（草案）[J].中国中西医结合杂志，1992，12（1）：56-56.

[6]陆德铭主编.普通高等中医院校规划教材·中医外科学[M].上海：上海科技出版社，1997：155-156.

[7]Marh SGE,Bodmer JG.HLA classⅡregion nucleotide sequences,1955[J].Tissue Antigens,1995,46:258-280.

[8]Olerup O,AldenerA,Fogdell A.HLA-DQB1 and-DQA1 typing by PCR amplification with sequence-specific primers(PCR-SSP)in 2 hours[J].Tissue Antigens,1993,41:119-134.

[9]Picard JK.Single-step allele-specific polymerse chain reaction HLA-DQ genotyping using ARMS primers[J].Hum Immunol,1993,38:115-122.

[10]赵桐茂.HLA分型原理和应用[M].上海：上海科学技术出版社，1984：146-147.

[11]Colombe BW,Lou CD,Price VH.The genetic basis of alopecia areata:HLA associations with patchy alopecia areata versus alopecia totalis and alopecia univeralis[J].J Investing Dermatol Symp Proc,1999,4:216-219.

[12]Akar A,Orkunoglu E,Sengül A,et al.HLAclassⅡalleles in patients with alopecia areata[J].Eur J Dermatol,2002,12:236-239.

[13]肖风丽，苗国英，张西克，等.HLA等位基因与皖籍汉族人群斑秃的相关性研究[J].安徽医科大学学报，2007，42（1）：67-69.