小麦面筋蛋白可控酶解机理及动力学特性研究*

崔洁，孔祥珍，华欲飞，周惠明

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

小麦面筋蛋白可控酶解机理及动力学特性研究*

崔洁，孔祥珍，华欲飞，周惠明

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江南大学食品学院，江苏无锡，214122)

采用Alcalase 2.4L FG对小麦面筋蛋白进行酶解，在温度60℃、pH 9.0的条件下通过探讨不同底物浓度及酶浓度的变化对水解度的影响，来研究小麦面筋蛋白的动力学特性，建立了关于水解速率及水解度的动力学模型，讨论了临界底物浓度和临界酶浓度，同时计算出米氏常数Km=1.321 1%、最大反应速率Vmax=0.327 9 mol/(L·h)，通过对动力学模型进行验证，发现与实际酶解情况间的误差很小，说明此模型具有良好的实际应用价值;还探讨了可控酶解机理，为更好地理解间歇酶解反应奠定了基础。

小麦面筋蛋白，碱性蛋白酶，酶解，动力学特性

小麦面筋蛋白作为生产小麦淀粉的副产物，是一种优质的植物蛋白，但其溶解性比较差，给综合利用带来了困难。小麦面筋蛋白在水相中的溶解性有限是由于蛋白分子比较大以及由非共价作用(包括氢键和疏水相互作用)引起的分子间聚集所造成的［1］;小麦面筋蛋白在天然态时的溶解性很低是因为所含非极性氨基酸残基很多，而可解离侧链氨基酸很少，研究表明，酶水解能够大大改善小麦面筋蛋白的溶解性及功能性质［2－4］。

蛋白质酶解技术是应用酶将蛋白质水解成分子量较小的多肽及氨基酸，以利于吸收及利用，通过控制水解条件及水解度可获得目标分子量的肽段。建立描述蛋白质酶解过程的动力学模型，不仅能从理论意义上加深对蛋白质酶解过程的理解，而且能有效地指导生产实践，从模型推算出获得目标水解产物所需的酶解条件。本实验拟对碱性蛋白酶水解小麦面筋蛋白的过程进行研究，从而建立酶解动力学模型，并阐述酶解反应机理，为进一步深入理解酶解过程及工业化应用提供科学依据及参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦面筋蛋，安徽瑞福祥食品有限公司，蛋白质含量70.95%;Alcalase 2.4L FG，诺维信(中国)生物技术有限公司，活力180 000 U/mL;其它试剂均为分析纯，市售。

GX-2005高温循环器，上海比郎仪器有限公司;90型恒温磁力搅拌器，上海沪西分析仪器厂;DELTA320PH计 Mettler-Toledo Instruments(SH)Ltd。

1.2 实验方法

1.2.1 pH-state法酶解过程

称取一定量的小麦面筋蛋白，在搅拌条件下慢慢加入到一定量的去离子水中，使之形成一定底物浓度的悬浮液，待底物分散均匀后，升温至60℃并调pH 9.0，平衡片刻后，按比例迅速加入一定量的酶液，反应过程中维持体系pH恒定，根据所加碱液体积计算不同时间的水解度。

1.2.2 水解度(DH)的计算

蛋白质的水解度指蛋白质在水解反应过程中被水解的肽键的百分数，采用pH-Stat法［5］，可由下式计算:

其中:B为所消耗的碱液体积，mL;Nb为碱液的当量浓度，mol/L;α为α-氨基解离度;Mp为底物中蛋白质的质量，g;htot为底物中蛋白质的肽键总数(mN/g白质)，对小麦面筋蛋白，htot=8.38。

2 结果与讨论

2.1 Alcalase酶解小麦面筋蛋白动力学模型研究

2.1.1 酶解动力学参数及方程的确定

Alcalase 2.4L FG酶解小麦面筋蛋白，该水解反应符合双底物顺序反应机理［6］，在pH值和温度恒定的条件下，总水解速率的指数形式动力学方程如下［7］:

该方程可描述水解度与水解时间的关系，相应的变化曲线呈现对数函数关系。本实验通过研究不同初始底物浓度及酶浓度对水解度的影响，从而确定动力学参数，进而确定动力学方程。酶解条件为:温度60℃、pH 值 9.0、底物浓度(1%、3%、5%、7%、9%)、酶浓度(0.025%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%)，酶解进程曲线如图1和图2。

图1 不同底物浓度的水解进程曲线

图2 不同酶浓度的水解进程曲线

根据上述实验数据，由不同底物浓度S0和酶浓度E0下的x、t值(即水解度与酶解时间)，采用SAS V8统计软件进行非线性回归分析，可求出相应的a、b值(见表1)。各组实验数据显示，b值的变化并不大，基本在其平均值0.209周围波动，也就是说，在pH及温度恒定的酶解反应体系中，b值接近一个常数;而a值随底物浓度S0的增大而减小，随酶浓度E0的增大而增大。

以a对E0/S0作图，如图3所示。

由上述方程可知，a与E0/S0的曲线关系所对应的方程为:

将上述求得的a值表达式和b的平均值代入方程(1)、(3)，可分别得到小麦面筋蛋白酶解的动力学模型方程。

表1 小麦面筋蛋白酶解动力学参数值

图3 a与E0/S0的相关性曲线

从方程(6)可以看出，当底物浓度和酶浓度一定时，随水解时间的延长，水解度增大;在水解时间一定的前提下，当酶浓度不变时，水解度随底物浓度的增大而减小;当底物浓度不变时，水解度随酶浓度的增大而增大;这与表1中所得参数值的变化相符合。

由水解速率方程可以分别得到小麦面筋蛋白酶解反应的临界酶浓度E0=(0.948 2/278.82)S0及临界底物浓度S0=(278.82/0.948 2)E0，也就是说，当低于此临界酶浓度或高于此临界底物浓度时，酶解反应很难发生或根本不会发生。

2.1.2 动力学模型的验证

选取E0/S0为0.010、温度 60℃、pH值9.0时的实际酶解进程曲线与理论模型计算所得的酶解进程曲线进行比较，结果如图4所示。

图4 动力学模型验证曲线

实验结果表明，由理论计算出的水解度绘制而成的酶解进程曲线与实际酶解进程曲线相当一致，误差很小，因此，该动力学模型具有很高的实际应用价值，可在实际中用来指导生产，计算不同水解时间所对应的水解度。

2.1.3 米氏常数Km和最大反应速率Vmax的测定

改变底物浓度及酶浓度，在60℃、pH值9.0的条件下进行酶解，通过不同条件下水解反应的初始速率，根据Lineweaver-burk双倒数方程，即:

以底物浓度的倒数为横坐标，初始反应速率的倒数为纵坐标作图求解，结果如图5所示。

图5 Lineweaver-burk法求Km和Vmax

由图5可知，直线回归方程为y=4.028 9x+3.049 7，由此方程可求出Alcalase 2.4L FG催化小麦面筋蛋白水解反应的米氏常数和最大反应速率，即Km=1.321 1%，Vmax=0.327 9 mol/(L·h)。

2.2 可控酶解反应机理的探讨

由图2和图3可以看出，无论如何改变底物浓度和酶浓度，Alcalase酶解小麦面筋蛋白的水解进程曲线都呈现出相同的趋势，即:在反应初始阶段，水解度的增加较快，随着反应的进行，水解度的增加变得缓慢，直至趋于恒定;同时，反应速率也随着时间的延长而快速下降，最后趋于0。分析引起这些现象的原因，主要包括以下几方面因素:

(1)底物-产物抑制。从图2可知，对于相同的底物浓度，当加酶量不同时，相应的水解度也不同，酶浓度越高，水解度越大。选加酶量为0.05%的情况为研究对象，在此条件下，酶解反应进行一段时间后，向体系补加一定量的相同浓度的新鲜底物蛋白溶液，发现水解度有所提高，如图6所示，从而推测水解度增加变缓可能是由于体系中可被酶解的肽键的摩尔浓度降低所造成的;但另一方面，当不补加底物而单纯加大酶用量时，水解度也呈现增大趋势，这就说明水解度增长速度减慢并不单纯是被底物中可被酶解的肽键的量不足所限制的，而是另有原因，即存在底物－产物抑制现象。

图6 补加底物后的酶解进程曲线

从图7可以看出，对酶解反应的初始速率而言，当底物浓度低于某一浓度值时，反应速率随底物浓度的增加而增加，这种情况发生在酶尚未被底物饱和之前;而当底物浓度高于这一浓度值时，反应速率会随底物浓度的继续增加而降低，这是由于酶在被饱和后又被高浓度的底物抑制了的缘故。如图1和图2所示，各种酶解条件下的酶解进程曲线都在反应一段时间后达到缓慢上升直至趋于恒定的趋势，这可能是由于随着反应的进行，生成的产物与酶发生可逆或不可逆结合从而表现出抑制作用的结果。

图7 小麦面筋蛋白酶解的M-M图

(2)酶失活。在酶解反应进行一段时间后，向体系补加一定量的新鲜酶液，发现水解度明显增加，如图8所示;同时，从图9中可以看出，在间歇酶解反应中，酶活力在初始阶段下降明显，之后下降逐渐变缓;上述现象都说明，在小麦面筋蛋白酶解过程中，存在酶失活的因素。

图8 补加酶后的酶解进程曲线

图9 Alcalase残余酶活力随时间的变化曲线

综上所述，使得Alcalase催化小麦面筋蛋白酶解进程曲线呈现出特定趋势的主要因素包括底物－产物抑制及酶解过程中存在的酶失活现象，同时，这些原因也可用来解释其它酶催化某种蛋白底物的酶解反应。

3 结论

(1)根据酶动力学的基本理论及推导，得到描述Alcalase 2.4L FG在温度60℃、pH值9.0的条件下催化水解小麦面筋蛋白的动力学方程，包括水解速率方程及水解度方程;经验证，模型预测结果与实际测得的结果相当一致，因此，该动力学模型具有很高的实际应用价值，可在实际中用来优化指导生产，计算不同水解时间所对应的水解度;还计算出米氏常数和最大反应速率，结果为Km=1.321 1%，Vmax=0.327 9 mol/(L·h)。

(2)探讨了由Alcalase 2.4L FG所催化的小麦面筋蛋白的可控酶解机理，找出了导致酶解进程曲线呈现“先快速上升再趋于平缓最后趋于恒定”态势的可能原因，包括底物－产物抑制及酶失活现象，这也可用来解释由其它酶所催化的蛋白底物的酶解反应机理，为更好地理解酶解过程提供科学依据。

［1］ Weegels P L，Verhoek J A，Hammer R J，et al.Effect on gluten of heating at different moisture contents.II.Changes in functional properties［J］.Cereal Sci，1994(19):39－47.

［2］ Batey I.Enzymatic solubilization of wheat gluten［J］.Appl Biochem，1985(7):423－429.

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［5］ Adler Nissen.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins［M］.London:Elsevier Applied Science Publishers，1986.

［6］ Volkert M A，Klein B P.Protein dispersibility and emulsion characteristics of flour soy products［J］.Food Science，1979(44):93－96.

［7］ 齐葳，何志敏，何明霞.蛋白质酶促水解反应机理与动力学模型［J］. 天津大学学报，2005，38(9):768－773.

Study on the Mechanism and Kinetics Characteristics of Controlled Enzymatic Hydrolysis of Wheat Gluten

Cui Jie，Kong Xiang-zhen，Hua Yu-fei，Zhou Hui-ming
(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and

Technology，Jiangnan University，Jiangsu，Wuxi 214122，China)

Wheat gluten was hydrolysed by Alcalase 2.4 L FG under the condition of 60℃and pH 9.0.The kinetics characteristics of wheat gluten were studied by discussing the influence of different substrate concentration and enzyme concentration on the degree of hydrolysis.Through the experiment，we not only established the kinetic models of both hydrolysis rate and degree of hydrolysis，but also discussed the critical substrate concentration and enzyme concentration，and simultaneously calculated the Michaelis constant Km=1.321 1%coupled with maximum reaction rate Vmax=0.327 9 mol/(L·h).It was found that the deviation between the theoretical value and actual value was very small，which indicated that the model has a good practical application value.Furthermore，the mechanism of controlled enzymatic hydrolysis was probed for a better understanding of intermittent hydrolysis reaction.

wheat gluten，Alcalase，hydrolysis，kinetics characteristics

硕士研究生(华欲飞为通讯作者)。

*国家863计划基金(2008AA10Z312);中央高校基本科研业务费专项资金资助(JUSRP10919)

2010－01－14，改回日期:2010－06－12