丙戊酰酪氨酸二肽Tyr-Tyr-VPA的固相合成*

伍江卓, 卢 奎,2, 赵东欣, 薛永亮, 王宏慧

(1. 河南工业大学 化学化工学院,河南 郑州 450001; 2. 河南工程学院，河南 郑州 451191)

多肽是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，可被广泛的用于医疗、卫生、保健、食品，化妆品等方面[1～5]。多肽的全合成不仅具有重要的理论意义，而且具有重要的应用价值，对化学、生化[6]、医药、免疫[7]及微生物学等领域都起了巨大的推动作用。

丙戊酸钠为抗癫痫药，在医药上用途很广，具有抑制肺癌细胞株增殖功能，有望用于治疗恶性肿瘤[8]。但丙戊酸钠对胃肠道有刺激性，吸收快，血浓度波动大，将其羧基修饰为酰胺基，形成丙戊酰胺，则毒性减小，吸收较慢，血浓度波动范围小。

本文设计并合成了丙戊酰酪氨酸二肽(Tyr-Tyr-VPA)，期望得到副作用更小的抗癫痫药物。以Wang树脂为固相载体，Fmoc-为α-氨基保护基，HBTU-HOBT为缩合剂，采用固相法合成了Tyr-Tyr-VPA(Scheme 1)，粗产率86.7%,其结构经IR和ESI-MS表征。

1 实验部分

1．1 仪器与试剂

岛津IR-Prestige 21型傅立叶变换红外光谱仪;Agilent 6310型离子阱液相色谱-质谱仪;Agilent 1100型高效液相色谱仪。

丙戊酸,纯度99.7%，盐城东阳生物制品有限公司；乙腈，色谱纯，TEDIA公司；氨基酸药品、苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU),一羟基苯并三唑(HOBt)，N,N-二异丙基乙胺(DIEA)， Fmoc-Tyr(tBu) Wang Resin(1,担载量0.53 mmol·g-1)， Fmoc-Tyr(tBu)-OH，三氟乙酸(TFA)和茚三酮,吉尔生化(上海)有限公司； 其余所用试剂均为分析纯。

®=Wang Resin

1．2 合成

(1) 脱Fmoc-保护

在固相合成管中加入Fmoc-1 500 mg, DMF 7.5 mL，静置溶胀30 min。抽滤，滤饼加入20%哌啶的DMF溶液7.5 mL,振荡30 min,抽滤,滤饼再加入20%哌啶的DMF溶液7.5 mL,振荡90 min，抽滤，滤饼用DMF(10×7.5 mL)洗涤(每次不少于1 min)得脱Fmoc-保护的1。

在小试管中加入1(4 mg～5 mg),滴加3滴茚三酮溶液，100 ℃水浴加热3 min，呈紫色或黑色为阳性，说明有游离的氨基存在，Fmoc-脱除完全；若无色或颜色较浅为阴性，表明Fmoc-脱除不完全，需重复脱Fmoc-保护过程至1呈阳性。

(2) 缩合

在试管中加入Fmoc-Tyr(tBu)-OH 365 mg, HOBT 107 mg, HBTU 302 mg和DMF 7.5 mL,振荡使其完全溶解后加入DIEA 263μL，混匀，室温下避光静置2 min～3 min得活化Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶液。

将活化Fmoc-Tyr(tBu)-OH溶液加入1中，于室温氮气吹动反应4 h，抽滤，滤饼用DMF(8×7.5 mL)洗涤(每次不少于1 min)，抽干得Fmoc-Tyr-1(Fmoc-2)(用Kaiser法监控至缩合反应进行完全)。

用类似1.2(1)方法对Fmoc-2进行脱Fmoc-保护得2。

将活化丙戊酸0.114 g加入2中，于室温氮气吹动反应4 h，抽滤，滤饼依次用DMF(3×7.5 mL),甲醇(3×7.5 mL)和二氯甲烷(3×7.5 mL)洗涤(每次洗涤不少于1 min)，抽干,用氮气吹干得浅黄色固体2-VPA(用Kaiser法监控至缩合反应进行完全)0.5 g,粗产率86.7%。

(3) 树脂切割

在烧瓶中加入树脂切割试剂[V(TFA) ∶V(三异丙基硅烷) ∶V(水)=95.0 ∶2.5 ∶2.5] 10 mL和2-VPA，磁力搅拌下于室温反应3 h。用砂芯漏斗滤入冰乙醚中，滤液在冰箱中静置2 h,离心收集沉淀得粗肽Tyr-Tyr-VPA。

(4) 纯化

用反相HPLC法纯化粗肽Tyr-Tyr-VPA, Eclipse XDB C18 5μm(150 mm×4.6 mm),柱温20 ℃，流动相:A=V(水) ∶V(乙腈)，梯度洗脱,基线:A=60 ∶40, 0 min～30 min: A=30 ∶70;检测波长254 nm，流速1 mL·min-1, tR=6.8 min。收集液旋蒸除去乙腈，冷冻干燥得白色粉末Tyr-Tyr-VPA。IRν: 3 297(O-H), 2 957(C-C), 1 637(C=O), 1 538, 1 513, 1 458(Ph), 1 240(C-O) cm-1; MSm/z: 470.8{[M+H]+}。

2 结果与讨论

本实验采用多肽固相合成法，选用Wang树脂为固相载体，以Fmoc-为α-氨基保护基，HBTU-HOBT为缩合剂，合成了丙戊酰酪氨酸二肽Tyr-Tyr-VPA，粗产率86.7%，粗产物用RP-HPLC进行制备。实验中，为了增加产率和缩短反应时间，可以延长脱Fmoc-保护和缩合反应时间，使每次洗涤时间减少至1 min。

不同的氨基酸保护基不同，需要选择不同的脱侧链和树脂切割方法，2-VPA的树脂切割试剂为TFA/三异丙基硅烷/水混合溶液。酪氨酸是疏水性氨基酸，滤入冰乙醚之后不出现沉淀，可以直接将冰乙醚旋蒸干，用甲醇溶解后进行反相HPLC纯化。

本方法反应条件温和，收率较高。

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