人血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1胞外区cDNA在婴儿双歧杆菌中的表达和鉴定

谢 清，张 萌

(四川省红十字肿瘤医院重症监护室，四川 成都 610041)

人血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1胞外区cDNA在婴儿双歧杆菌中的表达和鉴定

谢 清，张 萌

(四川省红十字肿瘤医院重症监护室，四川 成都 610041)

目的：构建携带重组基因sFlt-1的婴儿双歧杆菌基因转运载体系统，并观察其对人脐静脉内皮细胞生长的影响。方法：将编码血管内皮细胞生长因子受体sFlt-1 胞外区1-3loop316个氨基酸残基的cDNA插入到pET32a构建了重组表达质粒pET32a-sFlt-1,转化入婴儿双歧杆菌, 转化婴儿双歧杆菌，阳性克隆菌经质粒提取、酶切鉴定。结果：得到两条大小分别与基因sFlt-1及pET32a质粒片段大小相符的电泳条带，PCR检测到外源性sFlt-1基因已成功导入婴儿双歧杆菌，在体外实验中，重组质粒组人脐静脉内皮细胞形态出现明显改变，细胞生长受到明显抑制，而空质粒组细胞无明显变化。结论：成功构建携带重组基因sFlt-1的婴儿双歧杆菌基因转运载体系统。

血管内皮细胞生长因子；婴儿双歧杆菌；sFlt-1

抗肿瘤血管生成治疗是近年来抗肿瘤治疗研究中的一大热点，其治疗策略大体可分为抗血管生成和血管靶向两大类[1]，血管内皮细胞生长因子(VEGF) 受体Flt-1 属酪氨酸蛋白激酶受体家族第三亚型,是分子量约为180kD 的糖蛋白，分为胞外区、跨膜区和胞内区3部分，其中胞外区负责与配体结合，可特异性与VEGFR2结合而有效抑制血管内皮细胞增殖和血管生成具有7个免疫球蛋白样袢( Ig2like loop)，配体结合域位于氨基端3个loop内。

可溶性VEGFR是指VEGFR的胞外片断，它可游离于血液或组织液，具有抗血管生成的作用。可溶性Flt-1 (soluble Flt-1,s Flt-1)即是指KDR的胞外片断。本文以非致病性婴儿双歧杆菌作为抗肿瘤血管生成的靶向性基因转移载体，构建携带重组基因sFlt-1的婴儿双歧杆菌基因转运载体系统，并观察其对人脐静脉内皮细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1材料大肠杆菌(E.coli)JM109菌株(含质粒pET32a)及婴儿双歧杆菌2001为本实验室保种保存；重组质粒pcDNA3.1-sFlt-1为本实验室构建；限制酶、T4 连接酶及Taq DNA 聚合酶购自Promega公司。

1.2方法

1.2.1目的基因片段的扩增 引物由上海生工生物工程有限公司合成。上游引物: 5’-TGAGAATTCATG GAGAGCAAGG T-3’，下游引物: 5’-GTGCTCGAGTTTTTCATGGACCCT-3’，划线处为EcoRⅠ与XhoI酶切位点。以本实验室前期构建质粒pcDNA3.1- sFlt-1,PCR扩增条件为94℃45s，68℃45s，72℃60s,共30个循环，最后延伸10min。

1.2.2重组质粒的构建 将PCR产物与载体质粒pET32a，以EcoRⅠ与XhoI双酶切，后转化宿主菌DH5α,提取质粒DNA测序正确，并提取质粒进行PRC及酶切鉴定。

1.2.3重组质粒电穿孔法转化婴儿双歧杆菌 将新鲜制备的婴儿双歧杆菌细菌悬液、重组质粒pET32a-sFlt-1及电击杯置于冰上预冷5min，调节电穿孔仪至电脉冲为2.0kV，电阻200Ω，电容25μF，电击完后，迅速取出电击杯，并加入1ml的MRS液体培养基(含0.05%盐酸半胱氨酸和0.5mol/L蔗糖)，枪头混匀后，移至干净的EP管中，放入厌氧缸，通以混合气，置于37℃恒温培养箱孵育2.5h，取200μl菌液，用无菌弯头玻棒将其均匀涂抹在含氨苄青霉素(10μg/ml)的MRS固体培养基平板上(含0.05%盐酸半胱氨酸和0.5mol/L蔗糖)，置于室温直至液体被吸收。之后，将平板放进厌氧缸，37℃厌氧环境培养3～4d。

1.2.4重组阳性克隆株的筛选与鉴定 从Eryr MRS平板上挑选分离良好的单菌落，接种于5ml Eryr MRS液体培养基中，并往液体培养基表面滴加2滴石蜡油，于摇床上37℃振荡培养(130～150rpm)12～14h。取1ml培养液加入EP管，100℃水中煮5min，4000g离心10min，取上清6μl做PCR。

2 结 果

2.1目的基因的获取及重组质粒的双酶切鉴定PCR扩增的sFlt-1基因片段长度约为1000bp，与预计的大小969bp大小相符，与载体质粒pET32a连接后，转化宿主菌DH5α,提取质粒，DNA序列分析证实与国外文献报道一致。重组质粒pcDNA3.1- sFlt-1经EcoRI及XhoI双酶切鉴定,得到相应片段(见图1)。

2.2RT-PCR检测阳性转化菌中sFlt-1基因的表达以提取的阳性重组婴儿双歧杆菌总RNA作RT-PCR(见图2)。泳道2为RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，可见大小约969bp的特异性条带，证明外源基因Flt-1能够在婴儿双歧杆菌中表达。泳道3是以重组质粒pcDNA3.1-sFlt-1为模板扩增sFlt-1后经琼脂糖电泳所得的阳性对照条带。

3 讨 论

早在100多年前，就已发现肿瘤相对于正常组织内存在更多的血管[2]。Folkman等早在1971就已提出，可通过阻断肿瘤血管的生成来抑制肿瘤血管的生长、防止肿瘤的转移[3-4]，肿瘤生长对血管新生的依赖性得到普遍认可。抗肿瘤血管生成作为治疗肿瘤的一种方法，是通过阻断肿瘤周围形成新生血管、干扰营养肿瘤的血管网使其血供不足[2-5]，以达到“饿死”肿瘤的目的，其治疗策略大体分为抗血管生成和血管靶向两大类[1]。

实体瘤代谢的一个重要特点是瘤体内部的相对乏氧状态，而厌氧菌又具有趋低氧环境的特性，经静脉途径给予厌氧菌后，厌氧菌便靶向定植于实体瘤，并在肿瘤局部开始增生繁殖[6-7]。婴儿双歧杆菌是一类非致病性革兰氏阳性厌氧菌，寄居于人类及其他哺乳动物的低位小肠和大肠中，具保护宿主健康的作用，以它作为基因靶向转移载体的实验研究开展得非常多。

本实验成功构建了原核细胞表达质粒pET32a-sFlt-1，再利用电穿孔法将重组质粒pET32a-sFlt-1转化婴儿双歧杆菌，筛选出阳性菌落，提取其质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，同时对提取出的质粒进行双酶切鉴定，电泳得到两条大小分别约为969bp、5.9kb的片段，分别与sFlt-1基因和pET32a质粒大小相符，说明重组质粒pET32a-sFlt-1已成功导入婴儿双歧杆菌，为进一步探讨婴儿双歧杆菌介导的可溶性VEGFR基因转运系统在体内的抗血管生成作用奠定了基础。

[1] Eichhorn ME，Strieth S，Dellian M.Anti-vascular tumor therapy: recent advances，pitfalls and clinical perspectives[J].Drug Resistance Updates，2004，7(2)：125-138.

[2] Kerbel RS.A cancer therapy resistant to resistance[J].Nature， 1997，390(6658)：335-336.

[3] Sacco MG，Cato EM，Ceruti R，etal.Systemic gene therapy with anti-angiogenic factors inhibits spontaneous breast tumor growth and metastasis in MMTVneu transgenic mice[J].Gene Therapy，2001，8(1)：67-70.

[4] O'Reilly MS，Boehm T，Shing Y，etal.Endostatin： an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth[J].Cell，1997，88(2)：277-285.

[5] Rastinejad F，Polverini PJ，Bouck NP.Regulation of the activity of a new inhibitor of angiogenesis by a cancer suppressor gene[J].Cell，1989，96(3)： 345-355.

[6] Hanahan D，Folkman J.Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis[J].Cell，1996，86(3)：353-364.

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[编辑] 一 凡

R34

A

1673-1409(2010)02-R016-02

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.02.006

2010-03-01

谢清(1967-)，女，重庆沙坪坝人，主治医师，从事临床内科工作。