水通道蛋白4在外燥小鼠肺组织表达的实验研究

丁建中，贺尚荣, 张燕翔 (长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

李军川 (长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院病理科，湖北 荆州 434023)

王明明 (湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

水通道蛋白4在外燥小鼠肺组织表达的实验研究

丁建中，贺尚荣, 张燕翔
(长江大学医学院，湖北 荆州 434023)

李军川
(长江大学附属第一医院 荆州市第一人民医院病理科，湖北 荆州 434023)

王明明
(湖北中医药大学，湖北 武汉 430065)

目的：观察外燥对小鼠肺组织水通道蛋白4(AQP4)表达的影响。方法： 无特定病原体(SPF)级昆明种小鼠60只随机分为常温常湿组、常温燥组、温燥组和凉燥组，每组15只。免疫组化法检测各组第6、12、18天小鼠肺组织AQP4阳性表达并进行图像分析。结果：各组AQP4阳性表达部位多在肺泡上皮处。与外燥相关的3个组第12、18天AQP4蛋白表达阳性率持续下降(P<0.05)，伴明显肺部炎性病变。结论：外燥伤肺、耗津之时，伴肺泡液细胞内外转运相关的AQP4蛋白表达的下降，提示与其病机相关。

外燥；鼠；肺；水通道蛋白4(AQP4)

体内津液代谢主要与肺、脾相关，现在发现可以介导水的快速跨膜运动的非选择性细胞膜水通道蛋白(Aquaporin,AQP)有13种，提示AQP为津液输布的生物学基础之一。文献报道AQP4主要与脑水肿相关，敲除AQP4基因模型较野生型动物更易抑制脑水肿形成[1]；细菌内毒素诱导的急性小鼠肺损伤后4～12h明显肺水肿，伴肺泡AQP4表达减少，在第14天肺水肿减轻时AQP4表达有所恢复。在前期发现外燥可致小鼠肺组织炎性病变和肺组织AQP5蛋白表达下降的基础上[2-3]。笔者动态观察外燥对小鼠肺组织AQP4蛋白表达的影响为探寻与其病机特异性病理检测指标的相关性积累资料。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 实验动物 无特定病原体(SPF)级昆明种小鼠60只，体质量(17±1)g，雌雄各半，湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2008-2005。

1.1.2 试剂和仪器 LRH-250人工智能气候箱(广东医疗器械厂)，兔抗小鼠AQP4多克隆抗体试剂盒(DA0648，200902，武汉博士德公司)。

1.2方法

1.2.1 动物分组与造模 SPF级昆明种小鼠60只随机分为常温常湿组、常温燥组、温燥组和凉燥组，每组15只，分批置人工气候箱内常规饲养，按文献造模[4]。处理后第6、12、18天进行肺组织病理观察和AQP4蛋白表达检测。小鼠实验解剖前4h常规禁食、禁水。

1.2.2普通病理组织学观察 断颈处死小鼠，常规取右肺中叶组织2cm×2cm，HE染色，镜检。

1.2.3AQP4蛋白表达检测 取各组第6、12、18天小鼠右肺组织 (0.5cm×0.5cm)常规行免疫组织化学法染色。结果判断：光镜下以肺泡周围及肺泡上皮出现棕色颗粒为阳性；采用JEDA80ID(江苏捷达公司)图像分析软件计算 “平均灰度”与“异形指数”，并按下式计算AQP4阳性表达率：AQP4表达阳性率(%)= (肺组织AQP4阳性染色面积 /肺组织总面积) ×100%。

2 结 果

2.1病理观察常温常湿组第6天至第18天肺组织未见异常，常温燥组第12天肺部轻度充血；温燥组、凉燥组第6天肺泡充血，第12、第18天肺泡瘀血与炎性渗出物加重，伴明显肺气肿现象，肺泡隔处明显增厚伴炎性细胞浸润。

2.2外燥对小鼠肺组织AQP4表达的影响见表1。

表1 外燥对小鼠肺组织水通道蛋白4表达的影响

注：与常温常湿组比较，*P<0.05，**P<0.05; 与常温燥组比较，△P<0.05；与凉燥组比较，○P<0.05。

2.3外燥对小鼠肺组织AQP4的“平均灰度值”与异形指数的影响见表2。

表2 外燥对小鼠肺组织水通道蛋白4表达的“平均灰度值：与异形指数的影响

注：与常温常湿组比较，*P<0.05。

3 讨 论

构成水通道蛋白(AQPs)家族通道管上由His182、Arg197、Phe58和Cys191这4个氨基酸残基构成的狭口恰好是一个水分子的大小，每个亚单位构成孔径约0.38nm的水孔通道，其调节机制是通过翻译后蛋白修饰作用和改变单位面积上转运蛋白的含量，在渗透压驱动下实现水双向跨膜转运。AQP4之C端第276～280的5个氨基酸益于AQP4固定于细胞膜上， AQP4广泛分布于体内，包括中枢神经系统、肾、肺、结肠，也可在支气管上皮表达。文献报道AQP4主要与脑水肿相关，但AQP4剔除小鼠肺泡毛细血管间水渗透性较野生型小鼠低14～16倍[5-6]。临床常规用皮质醇类激素促进早产儿肺成熟，可能与促进AQPs表达及胎儿肺内液体吸收相关。

笔者的实验结果显示，AQP4蛋白多在肺泡上皮和肺泡膜缘表达阳性，与文献报道相符。常温燥组、凉燥组第6天AQP4蛋白阳性表达率略有升高，但与燥相关的3个组第12～18天持续下降，以第12天明显(P<0.05)；温燥组第6～18天AQP4表达阳性率持续下降、伴AQP4阳性表达点数增多(P<0.05)，显示外燥可致小鼠肺泡与肺液体细胞内外转运的水通道蛋白功能下降。

观测“平均灰度”与“异形指数”可辅之了解AQP4在肺组织的表达状态，表2结果显示常温常湿组第6～18天AQP4阳性表达之“平均灰度值”与“异形指数”相对稳定，湿燥组第6天AQP4阳性表达处的“平均灰度”下降，与燥相关的常温燥组、凉燥组与凉燥组第12～18天AQP4阳性表达处的“异形指数”呈相应下降(P<0.05)，显示其反应强度减弱。结果表明，温燥伤肺、耗津之时，首则肺组织失之濡养，继则肺泡液细胞内外转运相关的AQP4蛋白表达下降；同期病理组织学观察显示肺泡瘀血、肺泡隔增厚与炎性细胞浸润及“肺气肿”现象。AQP4作为与外燥伤肺病机之特征性检测指标的相关性值得研究。

[1]ZeleninaM， Zelenin S， Aperia A. Water channels (aquaporins) and their role for postnatal adap tation[J].Pediatr Res， 2005， 57(5 Pt 2)：47-53.

[2] 胡利群，丁建中.水通道蛋白与肺部疾病研究进展[J].长江大学学报：自科版医学版，2008，5(4)：83-86.

[3] 张六通，丁建中，王明明，等. 外燥对小鼠肺组织水通道蛋白5表达的影响及意义[J].湖北中医学院学报，2010，12(1):3-5.

[4] Matthay MA，Folkesson HG，Clerici C.Lung epithelial fluid transport and the resolution of pulmonary edema[J].Physiol Rev，2002，82(3):569-600.

[5] 丁建中，张六通，龚 权，等. 温燥致病机制的实验研究[J].中医杂志，2007，48(11)：1024-1026.

[6] 李波，陈东，王桂芳，等.水通道蛋白1、3、4、5在内毒素性急性肺损伤小鼠肺组织中的表达[J].第二军医大学学报，2008，29(2):131-135.

[编辑] 一 凡

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.03.001

R228.5

A

1673-1409(2010)03-R001-02