8个青花菜栽培品种的ISSR和SSR的遗传多样性分析

李昕珈，吴明根

(延边大学农学院，吉林 龙井 133400)

潘 刚

(浙江大学农学院，浙江 杭州 310029)

8个青花菜栽培品种的ISSR和SSR的遗传多样性分析

李昕珈，吴明根

(延边大学农学院，吉林 龙井 133400)

潘 刚

(浙江大学农学院，浙江 杭州 310029)

采用20个ISSR引物和100对SSR引物，分析了来自中国和美国的8个青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)栽培品种的遗传多样性。分别获得35个和22个多态性片段，平均分别为3.5个和2.2个；根据ISSR和SSR标记计算出品种遗传距离分别在0.271 3～0.970 2之间和0.175 7～0.922 3之间；聚类分析将8个品种分成2大类；根据2种标记计算的遗传距离及其遗传关系，所得结果基本一致，但存在一定差异。

青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)；ISSR；SSR；遗传多样性

青花菜(Brassicaoleraceavar.italica)又称绿菜花、绿花菜、茎椰菜、西兰花等，属十字花科芸薹甘蓝种中的一个变种。青花菜不仅营养成分含量高，而且十分全面，主要包括蛋白质、碳水化合物、脂肪、矿物质、维生素C和胡萝卜素等。此外，青花菜还具有抗癌功效，并含有丰富的抗坏血酸，能增强肝脏的解毒能力，提高机体免疫力[1]。

ISSR为显性标记，由Zietkiewicz等[2]于1994年发明，是建立在PCR技术基础上的一种新型的分子标记技术[3]。它结合了RAPD和SSR标记的优点，具有稳定性较高、重复性好、多态性高等特点，已在种植资源鉴定、遗传作图、基因定位、遗传多样化、进化、系统发育、分子标记育种等方面得到应用[4～6]，尤其被广泛用于芸薹属作物的遗传多样性研究[7，8]。而SSR标记则是一类共显性标记，其遗传方式简单、稳定性高、操作简便、重复性好，被广泛用于遗传作图、种质鉴定、分子标记辅助选择等方面[9]，被迅速应用于种质资源的评价和研究当中[10]。

本研究采用ISSR标记和SSR标记，从分子水平上研究不同地域、不同生育期青花菜品种的亲缘关系及遗传多样性的差异，以期为青花菜育种提供的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

选择来自国内外的8个青花菜品种为供试材料，其中国内6个品种为‘优秀’、‘未来’、‘山水’、‘山水’、‘早生’和‘曼陀绿’，2个国外品种为‘Arcadia’和‘Belstar’。

1.2 方法

(1)总DNA提取 每品种分别选取15粒种子，于28 ℃萌发，至2叶1心时取10株幼苗叶片混合，参照Saghai-Maroof等[11]的方法，采用CTAB小样法提取样品总DNA。

(2)PCR反应 ISSR分析引物采用加拿大哥伦比亚大学提供的序列(表1)，由上海生工生物工程公司合成20条引物。扩增反应条件为20 μL PCR反应体积，1×PCR缓冲液， 1 U Taq酶(北京鼎国)，50 ng模板DNA，1 μmol/L引物，1 mmol/L dNTP。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环，72 ℃延伸5 min。

表1 ISSR引物序列Table 1 The sequences of ISSR primers

SSR分析根据Iniguez-Luy等[12]的序列合成100对SSR引物，SSR反应参照Saal等[13]的方法，采用20 μL PCR体系。所有PCR扩增产物均用3%的琼脂糖胶进行分离。

(3)数据采集 根据分子标记的电泳谱带，分别统计各样本有多态性的ISSR和SSR扩增条带，有带记为1，无带记为0。

(4)遗传相似性分析 参照文献[14]利用DPS数据处理系统0-1数据系统聚类分析软件，采用Jaccard法计算遗传相似系数F，并按公式F=N11/(N-N00) 转换成遗传距离。其中，N为谱带位数；N11为2个个体都有带的位数；N00为2个个体都无带的位数。

(5)聚类分析 采用类平均UPGMA法做聚类分析，利用DPS数据处理系统0-1数据系统聚类分析软件分析[14]。

2 结果与分析

2.1 ISSR和SSR标记的遗传多样性分析

A～H为青花菜品种，M为DL2000图1 ISSR引物(ubc17)(a)和SSR引物(b)在材料中的扩增结果Figure 1 Amplified profile by ISSR primer (ubc17) (a) and SSR primer(b)

用20条引物对8个品种进行扩增，其中16条引物能够扩增出清晰的且可重复的带(图1a)，其中有多态性的引物为10条，共扩增出35个位点，多态性位点为13个，多态性位点百分率为37.14%，说明这8个品种间的遗传多样性一般。而100对SSR引物中，仅有10对存在多态性，每对引物检测到的多态性片段为1～3条(图1b)，平均每对引物2.2个，一共获得了22个多态性的位点。ISSR的平均扩增出的多态性标记数是SSR的1.59倍。

2.2 青花菜品种间的遗传分析

采用DPS数据处理系统根据青花菜任意2个品种的ISSR或SSR电泳条带数据，利用Jaccard法计算出各品种间的遗传相似系数，并转换成遗传距离。结果显示，ISSR标记计算的各品种之间遗传距离在0.271 3～0.970 2之间，最大值为0.970 2(‘优秀’与‘Arcadia’间)，最小值为0.271 3(‘Arcadia’与‘Belstar’间)。SSR分析显示，各品种间的遗传距离在0.175 7～0.922 3之间，最大值为0.922 3(‘Arcadia’与‘Belstar’间)，最小值为0.175 7(‘Arcadia’与‘Belstar’间)。这些结果显示，SSR标记结果的遗传距离的范围比ISSR大，而且两者之间也存在一定差异。相对而言，SSR标记比ISSR标记能检测到更大的遗传变异。

图2 8个青花菜品种的ISSR(a)和SSR(b)标记聚类图Figure 2 Dendrogram of 8 broccoli cultivars based on ISSR(a) and SSR(b)

2.3 青花菜的聚类分析

8个青花菜品种的Jaccard数据矩阵经DPS数据处理系统分析，以类平均法进行聚类分析。SSR聚类结果(图2b)显示，以0.57为界限可以将8个品种分成2大类，其中‘优秀’、‘未来’和‘早生’3个品种聚成一大类，其他5个品种聚为另一大类，2大类之间似乎与其生长特性没有什么关联。而ISSR聚类的结果(图2a)显示，以0.53为界限也可以将8个品种分成2大类，其中第一类仅有‘优秀’和‘未来’2个品种，而‘早生’则整合到另一大类。结果表明，ISSR的聚类结果与SSR的十分相似，但还是存在一定差异。

3 讨论

本研究利用ISSR标记和SSR标记对国内外8个主栽品种进行了遗传多样性分析，具有多态性的标记并不多，其中ISSR的为10条，占50%，而SSR则仅有10对，仅占10%。利用这些标记分析青花菜的结果表明8个品种基本可以分成2大类，但2种标记之间却存在一定差异，这与前人的研究结果[15]基本一致。2种标记存在一定差异可能与2种不同标记的特性有关，一是SSR标记检测的DNA重复序列，而ISSR却是检测重复序列间的DNA片段；二是SSR引物扩增条件相对稳定，重复性好，而ISSR引物由于存在一定的兼并碱基或重复序列，从而导致扩增的稳定性相对于SSR引物而言不太高。

遗传多样性的研究是青花菜种质资源研究的主要内容之一。利用分子标记技术，可以较为全面地了解现有青花菜种质资源的遗传多样性，从而可以根据品种间遗传距离选配强优势杂交组合，加快育种进程，减少育种中亲本选配的盲目性， 提高育种效率[16]。

[1]唐晓伟．西兰花营养最高[J]．花卉，2006，(7)：33～33．

[2]Zietkiewice E,Rafalski A,Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR) anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics,1994,20: 176～183.

[3]Lih S,Chen G Z.Genetic diversity of sonneratiaalba in China detected by inter-simple sequence repeat(ISSR) analysis[J].Acta Botanica Sinica,2004,46: 515～521

[4]王建波．ISSR分子标记及其在植物遗传学研究中的应用[J]．遗传，2002，24(5)：613～616．

[5]Doyle J J,Doyle J L.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue[J].Phytochem Bul,1987,19: 11～15.

[6]高 丽，杨 波．春兰ISSR-PCR反应体系的优化[J]．华中农业大学学报，2006，25(3)：305～309．

[7]郭小平，刘毓侠．SSR技术及其在植物遗传育种中的应用[J]．华北农学报，1998，13(3)：73～76．

[8]刘志文，单连民，韩 旭，等．现代生物技术在油菜遗传改良上的应用和进展[J]．华中农业大学学报，2007，26(6)：900～906．

[9]柳晓磊，汤 华，李东栋，等．椰子SSR反应体系的建立和优化[J]．华中农业大学学报，2007，26(5)：676～679．

[10]高志红，章 镇，韩振海．SSR技术及其在果树上的应用[J]．果树学报，2002，19(5)：281～285．

[11]Saghai-Maroof M A,Soliman K M,Jorgensen R A,etal.Ribosomal DNA spacer-length polymorphism in barley: mendelian inheritance,chromosomal location and population dynamics[J].Proc Natl Acad Sci USA,1984,81: 8014～8018.

[12]Iniguez-Luy F L,Voort A V,Osborn T C.Development of a set of public SSR markers derived from genomic sequence of a rapid cyclingBrassicaoleraceaL.genotype[J].Theor Appl Genet,2008,117: 977～985.

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[14]唐启义，冯明光．实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]．北京：科学出版社，2002．

[15]李进波，江良荣，李春海，等．水稻光温敏核不育系的ISSR和SSR遗传分析比较[J]．分子植物育种，2003，1(1)：42～47．

[16] Singh R K,Sharma R K,Singh A K,etal.Suitability of mapped sequence tagged microsatellite site markers for establishing distinctness,uniformity and stability in aromatic rice[J].Euphytica,2004,135: 135～143.

2009-11-18

李昕珈(1984-)，女，吉林吉林人，硕士研究生，主要从事杂草稻抗逆性及青花菜遗传多样性的研究.

吴明根，E-mail：5minggen@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.013

Q75

A

1673-1409(2010)01-S053-03