影响日本结缕草成熟种子愈伤组织诱导率和出愈时间的相关因子研究

刘雅丽，费永俊

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州430025)

曾会明

(北京林业大学草坪研究所，北京100083)

影响日本结缕草成熟种子愈伤组织诱导率和出愈时间的相关因子研究

刘雅丽，费永俊

(长江大学园艺园林学院，湖北 荆州430025)

曾会明

(北京林业大学草坪研究所，北京100083)

诱导率和出愈时间是愈伤组织诱导过程中的关键参数。本研究以日本结缕草(Zoysiajaponica)成熟种子为材料，研究了研磨、接种方式和浸泡等因素对愈伤组织诱导率和出愈时间的影响。结果显示，在MS + 2,4-D 5 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂7 g/L培养基上，pH5.8时，研磨处理的结缕草种子愈伤组织诱导率远高于未研磨处理的；随机接种方式的愈伤组织诱导率高于机械接种方式的；浸泡72h后愈伤组织诱导率高。结果表明，在研磨情况下，日本结缕草种子浸泡72 h后，采取随机接种方式，培养第5～7 d即出现愈伤组织，第9～11 d愈伤组织发生达到高峰期，第14 d便可进行继代培养，愈伤组织诱导率达95.6%。

日本结缕草(Zoysiajaponica)；愈伤组织；诱导率；出愈时间

结缕草(Zoysia)属禾本科画眉草亚科结缕草属，广泛分布于亚洲和大洋洲的热带、亚热带甚至温带地区，是当今世界上公认的优良暖季型草坪草种[1，2]，是唯一的国产草坪草，也是我国草坪植物中栽培最早、应用最多的草种之一。日本结缕草(Zoysiajaponica)具有耐践踏、富有弹性、抗旱、低矮致密、耐修剪、耐高温、对气候和土壤适应性广等许多的优良性状，在城市草坪和运动草坪中得到了广泛的应用[3，4]。

国内外学者对日本结缕草愈伤组织的诱导、再生分化体系进行了一些研究[5～11]。国内研究报道的结缕草成熟种子愈伤组织诱导率在34.2%～57.3%之间[5～7]。由于日本结缕草的诱导率较低、出愈时间较长[5～10]，高效组织培养体系和转化体系建立困难。本研究以日本结缕草成熟种子为外植体，研究浸泡、研磨和接种方式等因素对愈伤组织诱导的影响，以期为优化日本结缕草组织培养体系奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

日本结缕草‘Zenith’品种种子由美国TMI公司(Turf Merchants，Inc)惠赠。

1.2 材料消毒

种子置于50 mL离心管中，加入1～2滴Tween-20和35 mL次氯酸钠原液(有效氯gt;10.0%)，磁力搅拌器上搅拌1 h，无菌水冲洗5～6次，40 mL无菌水搅拌0.5 h，无菌水冲洗5～6次，加入20 mL无菌水置于4 ℃冰箱浸泡2～3 d。在超净工作台内用无菌水冲洗2次，加入35 mL次氯酸钠原液，再加去离子水至50 mL，搅拌20 min，无菌水冲洗5～6次，备用。

1.3 研磨处理

将经过消毒的种子用无菌水清洗3～5次，在接种前将种子在无菌研钵中研磨5 min。

1.4 浸泡处理

对无菌处理的结缕草成熟种子分别浸泡48 h、60 h和72 h，研磨后接种。每种处理5个重复，第3 d、5 d、7 d、14 d统计愈伤组织诱导率(其中第3 d的数据为发芽率)。

1.5 接种方式

机械接种：将种子一粒一粒排列接种于培养基上。每皿种子数为100粒。

随机接种：将随机所取的种子放置于无菌滤纸上，晃动滤纸，使种子自然分散，将滤纸倒扣于培养基上，揭去滤纸。每皿种子数100粒。

1.6 愈伤组织的诱导

将消毒处理过的种子接种在MS5+L-Pro培养基上，培养基为MS + 2,4-D 5 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH5.8，愈伤组织继代培养基为MSD(MS无机盐 + B5有机物)+ 2,4-D 1 mg/L + L-Pro 500 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂7 g/L，pH5.8。28 ℃黑暗培养，待种子萌发的芽基部出现白色的愈伤小块后，除去萌发的芽体，以促进愈伤小块的生长。接种15 d后对诱导出的愈伤进行继代培养。

2 结果与分析

2.1 研磨处理对日本结缕草种愈伤组织诱导率的影响

注:利用LSD法进行多重比较。同行标有不同大写字母者表示组间差异极显著，标有不同小写字母者表示组间差异显著。图2、图3同。图1 研磨处理对结缕草种愈伤组织诱导率的影响Figure 1 Effect of grinding on the induction of callus

将研磨和未研磨的结缕草种子采用机械接种方式接种至培养基上。接种第3 d种子胚处出现芽点，研磨处理的种子发芽率达到36.4%，而未研磨的发芽率仅1.4%；接种第5 d种子芽基部有白色突起，研磨后种子诱导率达到42.6%，而未研磨的仅为2.2%；接种第7 d白色突起形成愈伤组织，第9 d愈伤组织发生达到高峰期，接种第14 d即可对愈伤组织进行继代培养，此时研磨后种子的愈伤组织诱导率高达64.6%，未研磨的为11.4%(图1)。随着诱导时间延长，愈伤组织诱导率逐渐增加。在研磨处理下，第3 d、第5 d、第7 d和第14 d之间差异极显著；而未研磨处理的结缕草种子愈伤组织诱导率在第3 d、第5 d、第7 d之间差异不显著，第14 d与第3 d、第5 d、第7 d差异极显著(表1)。结果表明，研磨能显著提高日本结缕草愈伤组织诱导率。根据这一结果，以下实验均在研磨后进行。

表1 在不同处理下不同时间结缕草种子愈伤组织诱导率的变化Table 1 The change of callus induction rate at different time under different treatments %

注：利用Duncan法进行多重比较。同列标有不同大写字母者表示组间差异极显著，标有不同小写字母者表示组间差异显著。

2.2 接种方式对日本结缕草种愈伤组织诱导率的影响

将研磨后日本结缕草种子采取机械接种和随机接种2种接种方式接种于培养基上，统计愈伤组织诱导率。由表1可知，随着诱导时间延长，随机接种的愈伤组织诱导率逐渐增加，并且第3 d、第5 d、第7 d和第14 d之间差异极显著；但机械接种是愈伤组织诱导率在第3 d、第5 d、第7 d之间差异不显著，而第14 d与第3 d、第5 d、第7 d差异极显著。而且由图2可以看出，接种第3 d、第5 d和第14 d，随机接种愈伤组织诱导率极显著高于机械接种的。根据这一结果，以下实验采取随机接种。

图2 不同接种方式对结缕草种愈伤组织诱导率的影响Figure 2 Effect of transferring ways on the induction of callus

2.3 浸泡处理结缕草种子对愈伤组织诱导率的影响

图3 不同浸泡处理对结缕草种愈伤组织诱导率的影响Figure 3 Effect of immersing on the induction of callus

由表1可知，浸泡48 h和浸泡60 h的愈伤组织诱导率在第3 d、第5 d、第7 d和第14 d差异极显著，而浸泡72 h的在第3 d、第5 d差异显著，第7 d和与14 d差异不显著，结果表明，浸泡后结缕草种子愈伤组织诱导率随着诱导时间的延长而增加。由图3则可以看出，接种后第3 d、第5 d，浸泡48 h与浸泡60 h的愈伤组织诱导率差异不显著，但显著低于浸泡72 h的；接种第7 d、第14 d，3种浸泡时间愈伤组织诱导率差异极显著，而且浸泡72 h的愈伤组织诱导率最高。结果表明，结缕草种子研磨过的种子浸泡72 h后采用随机接种方式接种，愈伤组织诱导率最高。

3 小结与讨论

诱导率和出愈时间是单子叶植物遗传转化体系中的重要因素，本研究通过研磨、浸泡和接种方式等方式处理，缩短了出愈时间，提高了诱导率。

(1) 自1987年Al-Khayri等[11]以日本结缕草成熟种子建立植株再生体系后，不断有以日本结缕草茎尖、幼穗、节段为外植体建立植株再生体系的报道[6,12～14]。张俊卫等[7]认为诱导结缕草愈伤组织最佳2,4-D浓度为1～2 mg/L，愈伤组织诱导率最高可达57.3%。齐春辉等[5]则认为在培养基中加入营养物质可提高愈伤组织诱导率。但在本研究中，2,4-D浓度为5 mg/L的愈伤组织最高可达95.6%，明显高于张俊卫[7]、李瑞芬等[6]的结果，可能是因为本研究采用的物理手段打破了结缕草种的休眠，促进和诱发了结缕草愈伤组织的形成。

(2)研究表明，结缕草愈伤组织诱导在培养15～18 d后才观察到白色突起，20～25 d愈伤组织达到高峰期，30～40 d才能进行愈伤组织诱导率统计和继代[15～17]。而本研究表明，培养3 d观察到种子胚处出现芽点，培养5 d即可观察到种子芽基部有白色突起，7 d有愈伤组织形成，9 d愈伤组织达到高峰期，14 d即可对愈伤组织进行继代培养，大大缩短了出愈时间。

(3)本研究表明，研磨后的愈伤组织诱导率远远高于未研磨处理。可能是由于日本结缕草种子表层有较厚的保护层，研磨处理造成种子表层的保护层的破裂，打破了种子休眠，激发种子活性，提高种子的发芽率和愈伤组织诱导率。研磨处理时应以种子种皮磨损为宜。研磨程度过重，种子内部受损，发芽率自然不高，研磨程度过轻，种子外皮的蜡质保护层并没有受到破坏，种子发芽率也不高。

(4)研究表明，用水浸泡处理和综合处理的方法可以快速有效地促进种子发芽。方文娟[18]在对日本结缕草‘Zenith’品种浸泡处理时发现，该品种的最佳浸泡时间为2～3 d，愈伤组织诱导率增长了1.26倍，但随着浸泡时间再延长，种子生活力下降，愈伤组织诱导率也相应下降。本研究中浸泡72 h的日本结缕草种愈伤组织诱导率高于浸泡48 h和60 h，与方文娟的结果类似。

(5)在采用机械接种和随机接种2种接种方式时，试验结果差异极显著，原因有待进一步研究。

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2009-11-19

国家”863”计划(2006AA10Z132)；北京林业大学博士点基金(20070417)

刘雅丽(1985-)，女，湖北天门人，硕士研究生，研究方向为草坪草育种.

费永俊，E-mail:fyj2010@163.com

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.01.016

Q813.1

A

1673-1409(2010)01-S063-04