沙棘籽粕中生物碱及其抗心肌缺血活性

2010-11-24徐德平胡长鹰梅金龙唐年初赵晨伟

天然产物研究与开发 2010年6期

关键词：沙棘生物碱存活率

徐德平,胡长鹰,梅金龙,唐年初,赵晨伟

1江南大学食品学院,无锡 214122;2暨南大学食品科学与工程系,广州 510632

沙棘籽粕中生物碱及其抗心肌缺血活性

徐德平1＊,胡长鹰2,梅金龙1,唐年初1,赵晨伟1

1江南大学食品学院,无锡 214122;2暨南大学食品科学与工程系,广州 510632

从沙棘籽粕乙醇溶液中分离到三个生物碱,经波谱学方法及文献比较分别鉴定为 5,11-二羟色胺(1)、5-羟色胺 (2)和 Shepherdine(3)。化合物 1和 3在沙棘中首次报道。利用体外培养乳鼠心肌细胞,建立心肌缺血/再灌注损伤模型,发现 3个化合物对乳鼠心肌细胞缺血/再灌注(I/R)损伤有较好的保护作用。

沙棘;生物碱;沙棘碱

沙棘 (Hippophae rham noidesL.subsp.Sinensis Rousi)又名醋柳,为胡颓子科沙棘属植物,原产于青藏高原,我国主要分布在西北、西南、华北和东北等地[1],具有抗氧化、提高免疫力的功能[2-4]。沙棘籽乙醇提取物可提高小鼠红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和小鼠全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性,并能降低小鼠肝脏过氧化脂质含量;沙棘籽乙醇提取物可以清除 HO·并抑制 HO·所致的丙二醛的产生,减少 HO·所致的红细胞溶血,降低HO·所致线粒体肿胀程度,具有抗 HO·所致的氧化损伤的作用;同时沙棘籽乙醇提取物能显著提高小鼠(雌,雄)的碳廓清能力,增强小鼠 T淋巴细胞活性,促进溶血素的形成,具有提高小鼠免疫力的功能[5]。我们在对不同种沙棘籽粕提取物进行研究时,发现沙棘籽乙醇提取物不但有较好的抗氧化活性,也具有很好的抗心肌缺血活性。在对沙棘籽乙醇提取物的化学成分进一步研究时发现,沙棘籽乙醇提取物中不仅含有大量的原花青素,还含有一定量的生物碱。本文对沙棘籽中生物碱的提取分离和抗心肌细胞缺血活性进行报道。

1 实验部分

1.1 仪器与材料

旋转蒸发器 RE52CS(上海亚荣生化仪器厂); SHB-III循环水多用真空泵 (郑州长城科贸有限公司);ESI/MS质谱仪 (Micro-mass Ltd,UK),Buker Avance 500 MHz核磁共振仪 (瑞士 Bruker公司)。GF254硅胶板 (山东烟台芝罘化工厂);AB-8大孔吸附树脂(南开大学化工厂);Sephadex LH-20(Amersham Biosciences Co.)、Toyopearl HW-40(Tosoh Biosciences Co.)柱填料为进口分装。沙棘 (Hippophae rham noidesL.subsp.SinensisRousi)籽粕为沙棘籽经超临界 CO2萃取后的籽粕,由青海省康普生物公司提供。

1.2 提取与分离

称取 20 kg沙棘籽粕,按料液比 1∶7加入 70%乙醇,60℃提取 2 h,过滤,渣再重复提取 2次,滤液合并,减压浓缩至无乙醇为止。将乙醇提取物用三倍体积的乙酸乙酯萃取,反复多次,直到乙酸乙酯相无色时止。将乙酸乙酯萃取相合并浓缩得乙酸乙酯萃取物。将乙酸乙酯萃取物上大孔吸附树脂柱 (80 ×1500 mm,树脂为 AB-8),调节层析柱流速约 20 mL/min,依次用去离子水、不同浓度的乙醇梯度洗脱,500 mL收集一次,经 TLC鉴定,Rf相同的洗脱液合并,分成水洗脱部分 (A)、10%乙醇洗脱部分(B)、30%乙醇洗脱部分 (C)、50%乙醇洗脱部分(D)四个部分,各部分单独收集浓缩。将 C部分上SephadexLH-20柱(50×1000 mm),先用去离子水洗脱,再用不同浓度的乙醇梯度洗脱,每梯度洗脱 500 mL,20 mL收集一管,经 TLC鉴定和硫酸茴香醛显色,将 Rf值和显色相同的洗脱液合并,共得 a、b、c三个组分。将三个组分浓缩至一定体积后再分别反复上 HW-40柱(35×1500 mm),分别用 10%～30%的乙醇梯度洗脱,每梯度洗脱 300 mL,洗脱流速 10. 0 mL/min,20 mL收集一管,经 TLC鉴定纯度。共得3个纯化合物 1(123 mg)、2(76 mg)、3(325 mg)。

1.3 抗心肌缺血活性的研究

按文献[6]建立心肌缺血/再灌注损伤模型。取培养 3～4 d的乳鼠心肌细胞,分五组:正常对照组(control);缺血/再灌注模型组 (I/R);化合物 1、2、3给药组(浓度皆为 100 mg/L)。采用MTT法检测心肌细胞存活率;采用LDH(乳酸脱氢酶)、CK(肌酸激酶)含量的高低反映心肌细胞受损的程度。采用SPSS 13.0版统计分析软件进行统计处理,所有计量资料均用均数 ±标准差 (±s)表示,用单因素方差分析比较各组均数之间的差异。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

化合物 1 白色无定形粉末,溶于甲醇、乙醇,极易溶于水。ESI-MS给出 m/z:178[M+H]+,化合物 1分子量为 177,表明含有奇数个 N元素。1H NMR(D2O,500 MHz)δ:7.20(1H,dd,J=2.3,8.0 Hz,H-6),7.04(1H,d,J=2.3 Hz,H-4),6.98(1H, s,H-2),6.85(1H,d,J=8.0 Hz,H-7),4.10(2H,t,J =6.8 Hz,H-11),2.83(2H,t,J=6.8 Hz,H-10);13C NMR(D2O,125MHz)δ:151.5(C-5),134.5(C-7a), 130.7(C-3a),127.4(C-2),115.5(C-7),114.4(C-6),105.8(C-3),104.7(C-4),64.8(C-11),30.4(C-10)。上述数据与文献[7,8]报道一致,确定该化合物为 5,11-二羟色胺。

化合物 2 白色无定形粉末,溶于甲醇、乙醇,极易溶于水。ESI-MS给出 m/z:177[M+H]+,化合物分子量为 176。1H NMR(D2O,500MHz)δ:7.23 (1H,dd,J=2.6,8.0 Hz,H-6),7.12(1H,d,J=2.6 Hz,H-4),6.94(1H,s,H-2),6.73(1H,d,J=8.0 Hz,H-7),3.31(2H,t,J=6.2 Hz,H-11),2.74(2H, t,J=6.2 Hz,H-10);13C NMR(D2O,125 MHz)δ: 150.3(C-5),133.1(C-7a),128.6(C-3a),126.8(C-2),114.3(C-7),113.3(C-6),109.9(C-3),104.0 (C-4),41.1(C-11),24.1(C-10)。上述数据与文献[7,8]报道一致,确定该化合物为 5-羟色胺。

化合物 3 白色无定形粉末,溶于甲醇、乙醇,极易溶于水。ESI-MS给出m/z:203[M+H]+,HRESI-MS给出 m/z:203.2747[M+H]+,对应的分子式为 C12H14N2O。1H NMR(D2O,500 MHz)δ:7.27 (1H,dd,J=2.4,8.7 Hz,H-6),6.91(1H,d,J=2.3 Hz,H-4),6.78(1H,d,J=2.4 Hz,H-7),3.61(2H, t,J=6.4 Hz,H-11),2.83(2H,t,J=6.4 Hz,H-10),13C NMR(D2O,125 MHz)δ:151.0(C-5), 133.4(C-7a),133.3(C-2),128.2(C-3a),114.4(C-7),114.0(C-6),106.9(C-3),104.7(C-4),43.1(C-11),51.2(C-12),19.8(C-10),18.6(C-13)。上述数据与文献[9]报道的 Shepherdine数据一致,确定该化合物为 Shepherdine。

2.2 抗心肌缺血活性

化合物 1～3缺血/再灌注损伤乳鼠心肌细胞存活率的影响结果如表 1所示,化合物 1在 100 mg/L时,心肌细胞存活率高达 87.52%(P<0.01),化合物 3的活性相对较低,为 61.81%,实验表明三个化合物都能显著提高缺血/再灌注细胞存活率。

从表 1还可见三个化合物对心肌细胞缺氧/复氧后心肌细胞中 LDH(乳酸脱氢酶)、CK(肌酸激酶)含量的影响。化合物 1的乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量最低,分别为 28.75和 3.29 U/L,化合物 3的活性相对较低,其乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量分别为 41.71和 8.87 U/L。LDH、CK都是细胞能量代谢过程中重要的催化酶,当心肌细胞受到损伤,细胞膜破裂后可从细胞内释放,LDH、CK含量的高低反映出心肌细胞受损的程度。

本研究所分离到的三个生物碱都存在于动物脑组织和血液中,在植物中很少发现,并表现出对缺氧心肌细胞具有很好的保护。有关沙棘抗心肌缺血的活性研究很多,但大都以沙棘黄酮和原花青素为对象,而对沙棘籽粕中的生物碱及活性研究很少,本文为沙棘籽的研究与开发提供了新的物质基础。

表 1 化合物 1～3对缺氧心肌细胞的存活率以及LDH和 CK含量的影响(±s,n=4)Table 1 The effects of three compoundson the viability of cardiocytes injured andLDH and CK activity of cultured cardiocytes injured by I/R(±s,n=4)

＊P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsI/R group

Group Viability(%) LDH(U/L) CK(U/L) Control(空白对照组) 97.57±2.21 18.43±2.35 2.21±0.91 I/R(缺氧/复氧模型组) 41.36±3.42＊ 121.15±4.94＊＊ 24.63±1.89＊＊化合物1(100 mg/L) 87.52±2.96# 28.75±4.68## 3.29±1.21##化合物2(100 mg/L) 75.33±3.22# 32.59±2.74## 5.26±1.32##化合物3(100 mg/L) 61.81±2.64# 41.71±2.89## 8.87±1.45##

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Alkaloid aga inst Ischem ia/reperfusion Injury from Seeds ofH ippophae rham noidesL inn.

XU De-ping1＊,HU Chang-ying2,MEIJing-long1,TANGNian-chu1,ZHAO Cheng-wei11School of Food Science and Technology,Jiangnan University,W uxi 214122,China;2Depertm ent of Food Science and Engineering,Jinan University,Guangzhou 510632,China

Three alkaloidswere isolated from the ethanol extract of Seed ofHippophae rham noidesLinn and identified as 5-hydroxy-3-(2-Hydroxyethyl)indole(1),5-hydroxytryptamine(2),and shepherdine(3)by1H and13C NMR spectroscopic analyses.Neonatal rat cardiocyteswere cultured andmodelof ischemic/reperfusion(I/R)was established.The results showed three alkaloids have protective effects against the neonatal rat cardiocytes ischemia/reperfusion injured, and compounds 1 and 3 were isolated for the first time from this plant.

Hippophae rham noidesLinn seed;alkaloid;ischemic/reperfusion

1001-6880(2010)06-0937-03

2009-10-19 接受日期:2010-02-04

国家科技支撑计划(2007BAD83B02)

＊通讯作者 Tel:86-510-85329051;E-mail:xdp1219@sina.com

TS229;R972