东北红豆杉 (Taxus cuspidata)中四种紫杉烷类化合物抑制妇科肿瘤细胞增殖活性研究及其作用机制的初步探讨

李 珊,马如飞,王思明,张嫚丽,王于方,董 玫＊,史清文,张红真

1河北医科大学第一附属医院妇产科,石家庄 050031;2河北医科大学法医学系河北省法医学重点实验室,石家庄 050017;3河北医科大学药学院,石家庄 050017

东北红豆杉 (Taxus cuspidata)中四种紫杉烷类化合物抑制妇科肿瘤细胞增殖活性研究及其作用机制的初步探讨

李 珊1,马如飞2,王思明3,张嫚丽3,王于方3,董 玫2＊,史清文3,张红真1

1河北医科大学第一附属医院妇产科,石家庄 050031;2河北医科大学法医学系河北省法医学重点实验室,石家庄 050017;3河北医科大学药学院,石家庄 050017

通过四唑盐(MTT)比色法检测东北红豆杉中四种紫杉烷类化合物对人子宫颈癌细胞、人子宫内膜癌细胞、人卵巢透明癌细胞和人卵巢囊腺癌细胞增殖的影响,不仅探讨了这些化合物作用的构效关系,还初步探讨了其抑制肿瘤细胞增殖的作用机制。结果发现 9,10-去乙酰紫杉宁对人子宫颈癌细胞、人子宫内膜癌细胞和人卵巢囊腺癌细胞的增殖均有明显的抑制作用,与紫杉宁和 1β-羟基紫杉宁即使在 100μmol/L的高浓度下,对五种妇科肿瘤细胞的增殖不显示抑制活性;流式细胞学检查发现 9,10-去乙酰紫杉宁作用后的 HeLa细胞出现凋亡现象。因此推测:1.C-9,10位的羟基和 C-5位的肉桂酰基侧链是该类化合物抑制肿瘤细胞增殖所必需的;2. 9,10-去乙酰紫杉宁有可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现其抑制 HeLa细胞的增殖作用。

东北红豆杉;紫杉烷类化合物;肿瘤细胞;增殖活性;细胞凋亡

红豆杉(俗称紫杉,又称赤柏松,yew)在植物分类学上归属于裸子植物亚门 (Gymnospermae),松杉纲 (Coniferopsidae),红豆杉目 (Taxales),红豆杉科(Taxaceae),红豆杉族 (Taxeae)下的红豆杉属 (Taxus)。全世界约有 11种,主要分布于北半球,我国有4种 1变种,主要分布于甘肃、陕区[1,2],东北红豆杉为其中的一种。民间用红豆杉属植物的果实和枝叶煎汤用以驱虫、消积、润燥、利尿消肿、通经,治疗肾脏病、糖尿病、肾炎浮肿、小便不利、淋病、治疗月经不调、产后瘀血、痛经等并且可以治疗多种肠道寄生虫[3-6]。

由于从红豆杉科红豆杉属植物中发现了紫杉醇这一著名的抗肿瘤天然产物,红豆杉属植物成为近30年的研究热点。随着近年对紫杉醇及其前体物的需求量不断攀升,寻找新的生物资源保护生态环境已迫在眉睫。尽管目前已经提取分离得到了大量的紫杉醇类似化合物,但迄今为止仍没有紫杉醇的第二代药物上市。本文对从东北红豆杉 (Taxus cuspidata)的可再生资源部位小枝和针叶中分离纯化得到的四种紫杉烷类化合物进行抑制 HeLa等人妇科肿瘤细胞增殖活性研究,并进一步探讨其作用机制,为开发新的治疗妇科肿瘤药物提供理论依据。

1 材料、试剂与仪器

1.1 实验材料

试验用细胞株由日本千叶大学医学部第二生物化学教室提供。HeLa:人子宫颈癌细胞株[7];HEC-1:人子宫内膜癌细胞株[8];SH IN3和 HOC-21:人卵巢透明癌细胞株[8];HAC-2:人卵巢囊腺癌细胞株[8]。试验用正常细胞由河北医科大学基础医学院细胞生物学实验室提供。HELF:人胚肺成纤维细胞。紫杉烷类单体化合物 7-乙酰氧基-5-去桂皮酰基紫杉宁 (taxuspine F,1),紫杉宁 (taxinine,2),1β-羟基紫杉宁 (1β-hydroxyl-taxinine,3)和 9,10-去乙酰紫杉宁 (9,10-deacetyl taxinine,4)由河北医科大学药学院天然药物化学教研室从东北红豆杉的小枝和针叶中分离得到,经 1D-和 2D-NMR等波谱技术确定其结构如下(见图 1)。

图 1 四种紫杉烷类化合物化学结构Fig.1 Chemical structures of 4 non-paclitaxel-type taxoids

1.2 药品和试剂

MTT为美国 Sigma产品,批号:Lot.T W 074,日本和光纯药工业株式会社;SDS为美国 Biotec公司产品;胎牛血清为 G IBCO公司产品;RPM I 1640和胰蛋白酶为 G IBCO公司产品;AnnexinⅤFITC KIT为晶美生物工程有限公司产品;Taxol由河北医科大学药学院天然药物化学教研室提供。

1.3 仪器

生物显微镜:OLY MPUS,型号 JAPAN NO: 11058;CO2培养箱:MLO-18 A IL型,三洋电气公司产品;倒置相差显微镜:LH50A型,日本 OLY MPUS产品;超净工作台:BHL-1300-2 B型,Airtech Japan;精密电子天平 (分度值 0.01 mg):L IBROR AEL-40 S M No.04001003,SH IMADZU CORPORAT ION;80-2低速离心机:江苏富化仪器有限公司;YXQG 02式蒸汽消毒锅:山东新华医疗器械有限公司;DHX-9243B型(101-3 B)电热恒温鼓风干燥箱:上海福玛实验设备有限公司;酶标仪:S/N:E 11325型为美国Precision microplate reader公司产品;光学显微镜:日本OLY MPUS生产;培养板:美国 Costar公司产品;流式细胞仪:FACSCalibur型为美国 Becton Dickinson公司产品。

2 实验方法

2.1 肿瘤细胞株悬液制备[9]

用 RPM I1640完全培养液将被试肿瘤细胞株调整浓度为 2×105个细胞/mL的细胞悬液备用。

2.2 实验用化合物的体外抑瘤实验[10]

将被试肿瘤细胞株悬液接种于 96孔培养板,每孔 50μL(含 1×104个细胞),分别加入空白对照磷酸盐缓冲液、溶剂对照(终浓度 0.5%DMSO)、阳性对照紫杉醇以及终浓度为1μmol/L、10μmol/L、100 μmol/L的化合物 1～4各 50μL,每组均设 3个复孔。置于饱和湿度、37℃和 5%CO2培养箱中培养48 h,于培养结束前 4 h,各培养孔加入 5 mg/mL四甲基偶氮唑蓝 (MTT)10μL。培养结束后,弃去培养上清,每孔加入反应停止液 150μL,振荡 10 min,使结晶充分溶解,用酶联免疫检测仪检测各孔吸光度(OD)值,测定波长λ=570 nm,参考波长λ= 630 nm,并计算肿瘤细胞生存率。

肿瘤细胞生存率 (CS)%=实验组OD值/对照组OD值×100%

2.3 流式细胞仪及AnnexinⅤ-FITC试剂盒分析细胞凋亡

按左连富等[11]方法。HeLa细胞传代进入对数生长期,随机分组,实验组加入 50μmol/L的 9,10-去乙酰紫杉宁,空白对照组加入磷酸盐缓冲液,于培养 48 h后收集细胞,用 4℃预冷的 PBS洗细胞两次,用 250μL结合缓冲液重新悬浮细胞,调整其浓度为 1×106/mL,取 100μL的细胞悬液于 5 mL流式管中,加入 5μL AnnexinⅤ/FITC和 10μL 20 μg/mL的 PI溶液,混匀后于室温避光孵育 15 min,在反应管中加 400μL稀释好的结合缓冲液,及时上流式细胞仪分析。每次实验重复 3次。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 化合物 1～4对体外培养的 HeLa细胞增殖的抑制作用

结果如图 2所示,阳性对照紫杉醇显示强的抑制人子宫颈癌细胞 (HeLa)增殖活性的作用,用 1 μmol/L、10μmol/L和 100μmol/L的紫杉醇处理HeLa细胞,其肿瘤细胞生存率分别为 28.34%、22.82%和 15.23%;而 7-乙酰氧基-5-去桂皮酰基紫杉宁 (1)即使用 100μmol/L处理 HeLa细胞,其肿瘤细胞生存率仍为 100%,对 HeLa细胞的增殖不显示任何抑制活性;当用 100μmol/L的与化合物 1母核结构相同,在 5位碳原子上连接脂溶性的肉桂酰基侧链的化合物2、3和4处理HeLa细胞,其肿瘤细胞生存率分别为下降为 65.48%,51.27%和26.93%,并且与空白对照组相比较具有非常显著性差异。通过肿瘤细胞生存率和化合物 4浓度的对数回归方程 y=-12.595 Ln(x)+87.333,得到化合物 4对 HeLa细胞增殖的半数抑制浓度 (IC50)仅为19.38μmol/L。

3.2 化合物 1～4对其它四种妇科肿瘤细胞增殖抑制活性的影响

试验结果如表 1所示。阳性对照紫杉醇对人子宫内膜癌细胞 (HEC-1),人卵巢透明癌细胞株(SH IN3和 HOC-21)和人卵巢囊腺癌细胞株 (HAC-2)的增殖不显示任何抑制活性,I C50都大于 100 μmol/L。化合物 3仅对 HAC-2的增殖有较弱的抑制活性,其 I C50为 88.75μmol/L;化合物 4对 HEC-1和 HAC-2的增殖有较强的抑制活性,其 IC50分别为32.04μmol/L和 67.22μmol/L。化合物 1和 2对四种妇科肿瘤细胞的增殖均不显示抑制活性,其I C50都大于 100μmol/L。

3.3 化合物 1～4对人胚肺成纤维细胞增殖抑制活性的影响

实验结果如图 3所示,阳性对照紫杉醇对人胚肺成纤维细胞 (HELF)的增殖呈现较强的抑制活性,IC50为 8.77μmol/L,化合物 1仅在 100μmol/L剂量组显示较低的细胞增殖抑制活性,其细胞增殖生存率为 70.43%,C-5位具有肉桂酰基的其它三种试验用化合物 2～4对 HELF细胞的增殖不显示抑制活性,三种被试化合物的 IC50均大于 100μmol/L。

图 2 四种紫杉烷类化合物对人宫颈癌细胞增殖的影响Fig.2 The effect of four non-paclitaxel-type taxoids on the proliferation of HeLa tumor cell line

表 1 四种紫杉烷类化合物对四种妇科肿瘤细胞增殖活性的影响Table 1 The effect of three sesquiterpene lactones on the proliferation of other tumor cell line

图 3 四种紫杉烷类化合物对人胚肺成纤维细胞增殖的影响Fig.3 The effect of four non-paclitaxel-type taxoids on the proliferation of Human embryonic lung fibroblast

3.4 AnnexinⅤ-FIFC/PI双染流式细胞术检测结果

9,10-去乙酰紫杉宁 (4)以 50μmol/L处理 He-La细胞,于 48 h后进行Annexin-Ⅴ/PI染色,流式细胞仪检测,结果显示 HeLa细胞早期凋亡率为(48.51±6.84)%,PBS组为 (3.47±3.82)%,9, 10-去乙酰紫杉宁 50μmol/L浓度组与 PBS组相比,具有显著性差异 (P<0.05)。流式细胞检测提示9,10-去乙酰紫杉宁具有明显诱导 HeLa细胞凋亡的活性 (图4)。

图 4 9,10-Deacetyl taxinine对 HeLa细胞凋亡的影响Fig.4 The effect of 9,10-deacetyl taxinine on apoptosis of HeLa cell line

4 讨论

癌症是威胁人类健康的一大凶手,是仅次于心脑血管疾病的第二大致死性疾病,严重地威胁人类的健康和生命,妇科肿瘤又是临床最常见的恶性肿瘤,手术和放疗是妇科肿瘤常用的治疗手段,疗效肯定,但是中、晚期患者的治疗效果迄今仍较差,5年生存率徘徊在 50%左右。现在临床上应用的抗癌药物虽然种类不少,但价格昂贵,毒副作用严重,且尚没有治疗某些癌症的特效药。因此寻找疗效确切,作用机理清楚,治愈率高,毒副作用小的抗癌药物,攻克癌症成为全世界医药工作者亟待解决的一大课题。植物在其漫长的进化过程中合成了许许多多结构各异的次生代谢天然产物,这些次生代谢产物不仅具有不同的生物活性,还常常被发现有新的作用机制,象紫杉醇 (Taxol)、长春新碱 (Vincristine, VCR)、喜树碱 (Camptothecin,CPT)就是从植物中发现的三个优秀的天然抗癌药物中的代表,但彼此具有三个不同的甚至完全相反的抗癌作用机制,这些天然药物的发现和在临床上的广泛应用,极大地推动了化学家和药学家对抗癌药物的研发[12,13]。

东北红豆杉 (Taxus cuspidate)主产我国黑龙江省南部和吉林、辽宁等省,资源丰富,目前从东北红豆杉中提取分离得到的 130多种紫杉二萜类化合物,其中一些化合物显示了较好的抗肿瘤、抗炎、抗病毒等生物活性,非紫杉醇类紫杉烷类化合物如taxuspine D、taxezopidine K和 taxagifine显示出对CaCl2诱导的微管解聚作用有效的抑制活性[14-18]。紫杉烷二萜类制剂除紫杉醇外,还有泰索帝 (docetaxel)等,既可单独应用,又可与顺铂、卡铂等化疗药物联合使用。另外,王建华等[19]对从东北红豆杉中分离得到的 3种紫杉烷类化合物 2,9-diacetyl-5-cinnamoyl-phototaxicin II、5-acetyltaxuspineW 及 10-acetyltaxuspineB进行抗癌活性研究,发现 3个化合物对人乳腺癌细胞的增值均有明显的抑制作用。

本实验利用体外细胞培养方法,观察了东北红豆杉中 4种紫杉醇类单体化合物对人子宫颈癌细胞,人子宫内膜癌细胞,人卵巢透明癌细胞和人卵巢囊腺癌细胞增殖的抑制作用,实验结果表明这 4种化合物中 9,10-去乙酰紫杉宁对 HeLa细胞、HEC-1细胞和 HAC-2细胞均有较强的抑制活性,其半数抑制浓度 (IC50)分别为 19.38μmol/L,32.04μmol/L和 67.22μmol/L,但四种化合物对于正常的细胞,即人胚肺成纤维细胞的增殖不呈现抑制活性。4个化合物均为 6/8/6三环紫杉烷类且 C-13位均含有羰基,化合物 2～4在 C-5位具有肉桂酰基,化合物2和 3在 C-9和 C-10位均是乙酰基,而化合物 4在C-9和 C-10位均是游离的羟基;化合物 1在 C-5位没有肉桂酰基取而代之的是一个游离的羟基。由此我们推测 C-9,10位的羟基和 C-5位的肉桂酰基是该类化合物抑制肿瘤细胞增殖所必需的。

细胞凋亡又称程序性细胞死亡 (programmed cell death,PCD),是在一定的生理和病理情况下如细胞内环境的变化或死亡信号触发等,机体为维护内环境稳定,通过基因调控而使细胞主动死亡的过程。随着肿瘤分子生物学研究的深入,人们认识到肿瘤的发生和发展不仅与肿瘤细胞的增殖分化异常有关,而且同细胞凋亡的调控失常有关。肿瘤化疗的目标就是诱导肿瘤细胞凋亡。目前临床上使用的大多数抗肿瘤药物可诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡,其抗肿瘤效能与肿瘤细胞在药物诱导下发生细胞凋亡的内在活性有关[20]。为了进一步探讨东北红豆杉中单体化合物 9,10-去乙酰紫杉宁抑制 HeLa细胞增殖作用的机制,本实验利用 AnnexinⅤ-FIFC/ PI染色流式细胞仪检测法测定了 7-乙酰氧基-5-去桂皮酰基紫杉宁诱导 HeLa细胞的凋亡活性,实验结果显示,9,10-去乙酰紫杉宁以 50μmol/L处理HeLa细胞 48 h后,HeLa细胞早期凋亡率为 (48.51 ±6.84)%,与 PBS组相比,具有显著性差异 (P< 0.05)。实验结果提示东北红豆杉中单体化合物 9, 10-去乙酰紫杉宁抑制 HeLa细胞增殖作用可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。我们还将继续对该类化合物诱导细胞凋亡的作用机制进行深入的研究,尤其是通过哪些基因诱导肿瘤细胞凋亡方面,并着手临床应用的探索。

致谢:国家自然科学基金(8107255)的资助。

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Anti-proliferation Activity aga inst Tumor Cells of Non-paclitaxel-type Taxoids fromTaxus cuspidateand itsM echan ism

L I Shan1,MA Ru-fei2,WANG Si-ming3,ZHANGMan-li3, WANG Yu-fang3,DONGMei2＊,SH IQing-wen3,ZHANG Hong-zhen11The First Affiliated Hospital of HebeiM edical Uninversity,Shijiazhuang 050031,China;2Departm ent of ForensicM edicine,HebeiM edical Univercity,Shijiazhuang 050017,China;3Depar tm ent of M edicinal Natural Product Chem istry,School of Phar m aceutical Sciences,HebeiM edical University,Shijiazhuang 050017,China

Four non-paclitaxel-type taxoids taxuspine(1),taxinine(2),1β-hydroxyl-taxinine(3),and 9,10-deacetyl taxinine(4)were isolated fromTaxus cuspidata.Their anti-proliferation effects on the cell lines of HeLa,HEC-1, SH IN3,HOC-21,and HAC-2 were evaluated by usingMTT assay.In addition,the structure activity relationship and the possible mechanism were discussed.The results showed that only compound 4 exhibited significant anti-proliferation activities against HeLa,HEC-1,and HAC-2 cell lines and 9,10-hydroxyl and 5-cinnamoyl group were essential for the activity.Furthermore,the apoptosis induced by 9 in Hela cellwas studied by Flow Cytometry(FCM),which indicated that the anti-proliferation activity of 9,10-deacetyl taxinine was achieved by inducing HeLa cell apoptosis probably.

Taxus cuspidata;non-paclitaxel-type taxoids;human tumor cell lines;anti-proliferation activity;apoptosis

1001-6880(2010)06-1109-05

2009-05-14 接受日期:2010-07-07

国家自然科学基金(8107255)

＊通讯作者 Tel:86-311-8626-5602;E-mail:meidong@hebmu.edu.cn

R914;R284.3;Q946.91

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