罗伦隐球酵母对柑橘采后酸腐病的抑制效果*

刘 霞， 刘 莉， 王 鹏， 郑晓冬

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.杭州万向职业技术学院 生物技术系，浙江 杭州 310023；3.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310029)

罗伦隐球酵母对柑橘采后酸腐病的抑制效果*

刘 霞1， 刘 莉2， 王 鹏3， 郑晓冬3

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.杭州万向职业技术学院 生物技术系，浙江 杭州 310023；3.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310029)

研究了从梨果表面筛选分离到的罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)菌株对贮藏柑橘酸腐病菌(Geotrichumcitri-aurantii)的抑制作用.实验结果表明:在25 ℃，病原菌接种量一致的条件下，罗伦隐球酵母的生物防治效果与其接种浓度和其与病原菌接种间隔时间有关.当接种病原菌的量为1×106mL-1时，1×106mL-1拮抗酵母能有效地抑制酸腐病害的发生，拮抗酵母的接种浓度越高，其抑制效果越显著;罗伦隐球酵母同时或先于病原菌接种，可显著抑制酸腐病害的发生.柑橘果实接种罗伦隐球酵母24 h后，多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性升高，整个实验过程中均高于对照.采用不同的处理液处理柑橘果实，发现罗伦隐球酵母悬浮液和培养原液对酸腐病菌有较好的抑制效果，培养滤液和热杀死液也有抑制效果.研究结果表明罗伦隐球酵母菌株对柑橘酸腐病害有很好的防治潜力，其抑制机理可能与营养和空间竞争及分泌抗菌物质有关.

罗伦隐球酵母；柑橘；酸腐病；生物防治

柑橘是世界上产量最多的水果，也是我国南方的主要水果之一，它的营养价值丰富，而且具有抗癌功效[1-3].但是,柑橘在贮藏过程中有许多毁灭性的真菌病害，除了人们熟知的青霉和绿霉病害外，近年来由Geotrichumcitri-aurantii引起的酸腐病害发展最为迅速.目前，控制柑橘侵染性病害的主要措施是使用化学杀菌剂[4-5]，但许多柑橘常用化学杀菌剂如抑霉唑、噻菌灵等对酸腐菌没有抑制效果;另外,化学杀菌剂的长期使用易导致病原菌抗药性增强，防治效果降低[4,6].近年来的研究表明果蔬采后病害的生物防治是一项很有潜力的方法，被认为是最有希望替代化学杀菌剂的方法之一[7-8].本研究利用从梨果表面筛选到的酵母菌株，探讨了其对柑橘酸腐病菌的抑制效果和拮抗机理，旨在为拮抗酵母菌的商业化应用与开发提供理论依据.

1 材料与方法

1.1实验材料

(1)拮抗酵母.按Wilson等[9]的方法从梨果表面分离筛选.获得的罗伦隐球酵母菌株置于NYDA培养基(牛肉膏8 g，酵母粉5 g，葡萄糖10 g，琼脂20 g，水1 000 mL)上，4 ℃保存备用.

(2)病原菌.供试病原菌分离于自然发病的柑橘果实，经鉴定为柑橘酸腐菌(Geotrichumcitri-aurantii).将酸腐菌置于PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，水1 000 mL)上，4 ℃保存备用.

(3)柑橘果实.供试早橘采摘自浙江省千岛湖.选择饱满圆润、外观整齐、无干枯受伤和病害的果实，先用自来水清洗，然后浸入1 g/L的次氯酸钠溶液中消毒1～2 min，取出，再用自来水冲洗掉残余次氯酸钠，晾干，选择柑橘的赤道部位用灭菌的打孔器打一个直径5 mm，深2 mm的伤口.采用各种方式处理后的果实均放在400 mm×250 mm×100 mm的塑料筐中，保鲜膜密封后保湿培养.

1.2不同浓度酵母悬浮液对酸腐病菌抑制效果的影响

分别配制1×106,1×107,1×108,1×109mL-1拮抗酵母菌悬浮液，以无菌水作为对照.柑橘打洞后，按要求加入上述各酵母菌悬浮液30 μL，3 h后加入20 μL 1×106mL-1酸腐菌孢子悬浮液，将柑橘置于培养室中贮藏，贮藏温度为25 ℃，时间为5 d.每个处理分3组，每组随机挑选20个柑橘，贮藏结束后测定柑橘病斑直径，记录并计算发病率.实验重复2次.

1.3接种时间对病原菌抑制效果的影响

取30 μL 1×108mL-1酵母菌悬浮液接入柑橘伤口处，在接种酵母菌前12和24 h,同时(0 h)及后12和24 h的不同时间内分别接种20 μL酸腐菌孢子悬浮液，处理后风干，放置于贮藏室，贮藏温度为25 ℃，贮藏时间为5 d，贮藏结束后测量病斑直径，记录并计算腐烂率.每个处理分3组，每组随机挑选20个柑橘.实验重复2次.

1.4拮抗酵母对柑橘果实PPO和POD活性的诱导

取30 μL 1×108mL-1酵母菌悬浮液接入柑橘伤口处，于不同时间间隔(0,24,48,72,96 h)取样测定多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)活性，以接种无菌水的果实作为对照，每次测定的样品取自10个果实(伤口与完好组织的交接部位).整个实验重复2次.

3 g果肉组织中加入1 g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，再加入0.2 mol/L磷酸缓冲液10 mL(pH 7.8)，冰浴中研磨，12 000 r/min冷冻离心(4 ℃)20 min，上清液用于酶活性测定.PPO活性测定采用邻苯二酚法[10]；POD活性测定采用愈创木酚法[11].

1.5拮抗酵母各种处理液对柑橘酸腐菌的抑制

分别配制1×108mL-1酵母培养液、1×108mL-1酵母菌悬浮液、滤液和热杀死液，以无菌水作为对照.取上述处理液30 μL加入柑橘伤口处，3 h后再加入20 μL 1×106mL-1酸腐菌孢子悬浮液.5 d后测量病斑直径，记录并计算发病率，每个处理分3组，每组随机挑选20个柑橘.实验重复2次.

1.6数据处理与分析

采用SAS软件(Version 6.08,SAS Institute Inc.,Cary,NC)进行数据统计，数据采用ANOVA进行邓肯式差异分析方法(Plt;0.05).

2 结果与分析

2.1酵母悬浮液对柑橘采后酸腐病的防治效果

实验结果表明:罗伦隐球酵母悬浮液的浓度越高,对Geotrichumcitri-aurantii引起的柑橘果实酸腐病发病率和病斑大小的抑制效果就越好.贮藏5 d后，1×109mL-1酵母悬浮液的抑制效果最好，果实发病率为20.8%，平均病斑直径为7.0 mm，与其他浓度酵母悬浮液的处理效果存在显著差异;其次是1×108mL-1酵母悬浮液，果实发病率为32.5%，病斑直径为13.5 mm.酵母悬浮液浓度降低，其抑制效果也下降，但与对照的发病率和病斑直径相比仍存在差异(见图1).

图1 不同浓度罗伦隐球酵母悬浮液对柑橘酸腐病的抑制效果

2.2接种时间间隔对病原菌抑制效果的影响

图2 罗伦隐球酵母与酸腐菌接种时间间隔对柑橘酸腐病害抑制效果的影响

实验结果表明:在25 ℃,罗伦隐球酵母悬浮液先于或同时于酸腐菌接种时可显著抑制酸腐病害的发生;相反,罗伦隐球酵母后于酸腐菌接种时,酸腐病害发病率与对照相比差异不显著(见图2).

2.3拮抗酵母对柑橘果实PPO和POD活性的诱导

由图3可知，接种罗伦隐球酵母悬浮液能够诱导采后柑橘果实中PPO和POD活性的升高.接种拮抗酵母后，柑橘果实的PPO活性持续升高，48 h时达到最高峰，其值约为对照的1.4倍,随后PPO的活性逐渐下降;而柑橘果实的POD活性在24 h以前一直处于下降的趋势，24 h时达到最低点，随后活性逐渐升高，48 h时达到最高峰，其值约为对照的1.5倍.但是,在整个实验过程中，接种拮抗酵母果实的PPO和POD活性明显高于对照.

2.4拮抗酵母各种处理液对柑橘病害的抑制效果

实验结果表明:1×108mL-1罗伦隐球酵母悬浮液与培养原液处理的柑橘果实在25 ℃贮藏5 d，酸腐病的发病率和病斑直径都显著低于滤液、热杀死液处理的柑橘和对照(见图4).罗伦隐球酵母悬浮液处理的果实酸腐病发病率和病斑直径为32.5%和7.0 mm，明显低于对照的发病率(88.5%)和病斑直径(23.5 mm).但是，实验结果还表明:滤液和热杀死液对酸腐病菌也有抑制效果，而且滤液的抑制效果显著好于热杀死液，其发病率和病斑直径分别为60.5%和13.5 mm,79.5%和20.0 mm.

图3 罗伦隐球酵母对柑橘果实PPO和POD活性的影响

A：热杀死液；B：滤液；C：培养原液(1×108 mL-1)；D：酵母悬浮液(1×108 mL-1)图4 罗伦隐球酵母不同处理液对柑橘酸腐病害的抑制效果

3 讨 论

生物防治是采用微生物菌株或抗菌素类物质，通过喷洒或浸渍果实，以降低或防治果实采后病害的保鲜方法[12].文献[13]曾报道Debaryomyceshansenii对柑橘采后绿霉、青霉和酸腐病害有很好的抑制效果.柑橘采后青霉和绿霉病害也能够分别被粘红酵母和枯草芽孢杆菌PY-1所抑制[14-15].文献[16]报道了Cryptococcuslaurentii(Kufferath) Skinner对柑橘采后青霉病害有很好的抑制效果.本实验结果表明:从梨果表面分离得到的罗伦隐球酵母菌株对贮藏柑橘酸腐病有抑制作用;在25 ℃,当接种酸腐菌1×106mL-1时，拮抗酵母的接种浓度越高，抑制效果越好;罗伦隐球酵母先于或同时与病原菌接种，5 d后能够较好地抑制酸腐病的发生，而后于病原菌接种则无防治效果.

长期以来，PPO一直被认为是引起果实褐变的主要因素[17]，而它在植物抗病反应中也发挥着重要的作用[18].PPO可催化木质素及其他酚类氧化产物的形成，构成保护性屏蔽而抵抗病菌的入侵，也可以通过形成醌类物质直接发挥抗病作用[18].而POD在木质素生物合成的最后一步中催化H2O2分解而发挥作用.本实验发现，接种拮抗酵母24 h后能诱导柑橘果实PPO和POD活性升高，而且一直处在高于对照的水平,与此相伴随的是:果实的发病率低，病斑直径也较小.说明拮抗酵母对酸腐病菌的拮抗作用与诱导果实PPO和POD活性的提高存在着显著关系.

本研究中拮抗酵母的培养原液和悬浮液对柑橘酸腐菌都有显著的抑制作用，而滤液与热杀死液对柑橘果实酸腐病害的发生也有抑制作用，只是与前两者相比效果稍差.但这也说明，罗伦隐球酵母在培养过程中可能会分泌一些对酸腐菌有抑制作用的物质，该物质的成分还需要进一步分析研究.

总之，罗伦隐球酵母的拮抗机理被认为主要是营养与空间竞争[19].另外，与病原菌粘合[20]、诱导果实抗性或抗性相关反应[21]、降解病原菌分泌的真菌毒素[22]等也有报道.而在抵御由Geotrichumcitri-aurantii引起的柑橘果实酸腐病的过程中，除了营养与空间竞争和诱导抗性反应外，拮抗酵母所分泌的物质也发挥了重要作用.但是,拮抗酵母拮抗效果的产生往往是多种机制共同作用的结果.因此,该酵母是否存在着其他的拮抗机制还有待于进一步探讨.

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(责任编辑 薛 荣)

EfficacyofbiologicalcontrolsourrotofcitrusfruitbyCryptococcuslaurentii

LIU Xia1, LIU Li2, WANG Peng3, ZHENG Xiaodong3

(1.CollegeofChemistryandLifeScience,ZhejiangNormalUniversity,JinhuaZhejiang321004,China; 2.DepartmentofBiotechnology,HangzhouWanxiangPolytechnic,HangzhouZhejiang310023,China; 3.DepartmentofFoodScienceandNutrition,ZhejiangUniversity,HangzhouZhejiang310029,China)

Sour rot of citrus fruit could be significantly suppressed byCryptococcuslaurentii. The biocontrol efficacy ofC.laurentiiwas related to the concentrations of the yeast cells and application time. Higher efficacy was achieved when fruits were treated with high concentration ofC.laurentii(gt;1×106mL-1) and with low concentration ofGeotrichumcitri-aurantii(1×106mL-1) at 25 ℃. The efficacy ofC.laurentiiwas consistent when applied at the same time or before the pathogen. The activities of PPO and POD in citrus increased significantly after 24 h of inoculation withC.laurentii. The biocontrol mechanism ofC.laurentiiwas detected by comparing the efficacy of different treatments. The results demonstrated that the disease incidence for the treatments of living cell suspension and washed cell suspension ofC.laurentiiwas significantly lower than that for the culture filtrate and autoclaved cell suspensions. It was suggested thatC.laurentiihad a great potential to control sour rot of citrus fruit. The biocontrol mechanism might be the competition of nutrition and space, and secretion of antagonistic substances.

Cryptococcuslaurentii; citrus; sour rot; biological control

1001-5051(2010)01-0013-05

2009-12-29

“十一五”国家科技支撑计划重点项目(2006BAD22B02)；浙江师范大学博士科研启动资金资助项目

刘 霞(1977-)，女，山东济宁人，讲师，博士.研究方向：果蔬病害生物防治.

S432.4+4

A