PARP-1 mRNA表达在急性坏死性胰腺炎大鼠肺损伤中的作用

2010-11-23余佳王卫星徐胜邓文宏陈晓燕崔周军陈辰

中华胰腺病杂志 2010年1期

余佳王卫星徐胜邓文宏陈晓燕崔周军陈辰

·短篇论著·

余佳王卫星徐胜邓文宏陈晓燕崔周军陈辰

急性胰腺炎肺损伤(acute pancreatitis associated-lung injury，APALI)是重症急性胰腺炎(SAP)最常见胰外并发症，也是SAP患者早期病死的主要原因[1]，其发病机制至今仍未完全阐明。研究表明，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP-1)在众多生物学过程中发挥广泛的生理作用，与多种炎症疾病如脓毒症、胰腺炎并发的多器官功能障碍等的发生发展有关[2-4]。本实验观察PARP-1 mRNA在急性坏死性胰腺炎(ANP)大鼠肺组织中的表达，并探讨其在肺损伤发病机制中的作用。

一、材料与方法

1．实验动物及分组：SPF级6～7周龄雄性Wistar大鼠32只，体重200～240 g，购自湖北省疾病控制中心。按数字表法随机分为假手术组及ANP 3、6、12 h组，每组8只。采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠(美国Sigma公司)1 ml/kg体重方法制备ANP模型。假手术组开腹后仅翻动十二指肠和胰腺即关腹。

2．标本采集和检测指标：术后3、6、12 h分批处死大鼠，心脏采血，分离血清，以全自动生化分析仪采用酶显色法测定血清淀粉酶水平。取胰腺头部和右肺下叶经4%多聚甲醛固定后，包埋、切片、HE染色，由两位病理科医师采用双盲法在光镜下观察胰腺及肺组织病理学改变并评分。胰腺病理评分参照Schmidt法[5]；肺组织病理评分参照Osman法[6]。取右肺中叶，以吸水纸拭去表面血迹和水分，称湿重后85℃烘烤48 h再称重，计算肺组织的湿/干比。其余肺组织经液氮固定，-80℃冻存。取约80 mg肺组织，用Trizol提取总RNA。采用RT-PCR方法测定肺组织PARP-1mRNA表达。PARP-1(442 bp)上游5′-ACGCACAATGCCTATGAC-3′，下游5′-CCAGCGGAACCTCTACAC-3′；β-actin(207 bp)上游5′-CCAACTGGGACGATATGGAG-3′，下游5′-CAGAGGCATACAGGGACAAC-3′，引物由Invitrogen公司合成。PCR反应条件： 94℃ 5 min，94℃ 30 s、53.7℃(PARP)或54℃(β-actin)30 s、72℃ 1 min，35个循环，72℃延伸7 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，应用图像分析仪扫描，以PARP-1与β-actin条带光密度比值表示PARP-1 mRNA的表达量。

二、结果

1．一般情况：造模后ANP组大鼠精神和活动度变差，蜷缩，烦渴，毛色不匀齐且光泽晦暗。12 h时死亡1只(12.5%)。

2．血清淀粉酶的变化：假手术组和ANP 3、6、12 h组的血清淀粉酶水平分别为(1179±3235)U/L、(3864±529)U/L、(4876±805)U/L、(6532±1050)U/L，呈时间依赖性明显升高(P<0.05)。

3．胰腺组织病理改变：ANP组胰腺有不同程度的水肿、出血及片状坏死，腺叶间隙增宽和炎性细胞浸润。假手术组和ANP 3、6、12 h组的胰腺病理评分分别为0.28±0.05、6.38±0.76、8.73±0.55、11.4±1.13，呈时间依赖性明显升高(P<0.05)。

4．肺组织病理改变及湿/干比的变化：ANP 3 h组肺组织充血、出血、间质水肿，肺泡间隔增宽，炎症细胞浸润；6 h组肺泡腔内渗出液增多，部分肺泡萎缩或形成肺大泡，肺组织结构破坏，炎性细胞浸润增加；12 h组可见出血和大片实变(图1)。假手术组和ANP 3、6、12 h组的肺组织病理评分分别为0.22±0.02、1.21±0.11、1.72±0.14、2.2±0.35；湿/干比分别为1.77±0.23、2.05±0.12、2.43±0.14和2.97±0.36，均呈时间依赖性明显升高(P<0.05)。

图1假手术组(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)组肺组织的病理改变(HE ×200)

5．肺组织PARP-1 mRNA表达的变化：假手术组和ANP 3、6、12 h组肺组织PARP-1 mRNA表达量分别为0.13±0.04、0.25±0.07、0.37±0.11、0.51±0.14(图2)，呈时间依赖性升高(P<0.05)。肺组织PARP-1 mRNA表达与胰腺组织病理评分、肺组织病理评分均存在正相关关系，其相关系数分别为0.943、0.963(P<0.05)。

图2假手术组(1，5)和ANP 3(2，6)、6(3，7)、12 h(4，8)组肺组织PARP-1 mRNA的表达

讨论多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)是一类普遍存在于真核细胞(除外酵母菌)中的蛋白质翻译后修饰酶，是一个至少由18种蛋白组成的大家族，包括PARP-1、PARP-2、PARP-3、Vault-PARP和Tankyrases等亚型[2]。PARP-1约占细胞PARP活性的90%以上[7]，被认为是DNA损伤的感受器，在修复DNA断裂、维持基因组的完整性方面起着重要的作用。

PARP-1所涉及炎症的病理过程，包括关节炎、Crohn病、溃疡性结肠炎，以及脓毒症、严重烧伤、胰腺炎并发的多器官功能障碍等[3]。过强的DNA损伤可引起PARP-1过度激活，产生的PAR会导致尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和ATP耗竭，同时也破坏了细胞核内的稳态环境，引起细胞死亡、组织损伤和器官衰竭，导致病情恶化甚至死亡率升高[2-4]。本实验结果显示，制模后大鼠血清淀粉酶升高，胰腺病理损伤加重，肺组织湿/干比和病理评分明显升高。同时，肺组织PARP-1 mRNA表达逐渐上调，且表达水平与胰腺损伤程度、肺损伤程度呈正相关，表明大鼠肺组织内PARP-1参与了胰腺炎时肺损伤的发病过程，与Mota等的研究结果一致。其机制可能是：(1)通过激活NF-κB等炎症信号通路，引起TNF-α、IL-1等炎症介质产生和释放增多，造成器官组织损伤；(2)嗜中性粒细胞NADPH氧化酶释放，促使活性氧生成增加，引起DNA单链断裂，导致PARP-1过度活化和细胞能量储备的耗竭，从而使线粒体氧自由基产生，胰腺和肺脏细胞坏死[8-9]。

[1] Lund H,Tønnesen H,Tønnesen MH,et al.Long-term recurrence and death rates after acute pancreatitis.Scand J Gastroenterol,2006,41: 234-238.

[2] Amé JC,Spenlehauer C,de Murcia G.The PARP superfamily.Bioessays,2004,26: 882-893.

[3] Cuzzocrea S,Wang ZQ.Role of poly (ADP-ribose) glycohydrolase (PARG) in shock,ischemia and reperfusion.Pharmacol Res,2005,52:100-108.

[4] Jagtap P,Szabó C.Poly (ADP-ribose) polymerase and the therapeutic effects of its inhibitors.Nat Rev Drug Discov,2005,4:421-440.

[5] Schmidt J,Lewandrowsi K,Warshaw AL,et al.Morphometric characteristics and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat.Int J Pancreatol,1992,12:41-51.

[6] Osman MO,Kristensen JU,Jacobsen NO,et al.A monoclonal anti-interleukin 8 antibody (WS-4) inhibits cytokine response and acute lung injury in experimental severe acute necrotising pancreatitis in rabbits.Gut,1998,43: 232-239.