血卟啉衍生物光动力治疗人胰腺癌细胞的实验研究

于钟 黄开红 王凌云 朱兆华 陈汝福 张晋昕

·论著·

血卟啉衍生物光动力治疗人胰腺癌细胞的实验研究

于钟 黄开红 王凌云 朱兆华 陈汝福 张晋昕

目的研究血卟啉衍生物光动力治疗(photodynamic therapy, PDT)对体外培养的人胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应及其规律。方法以Biolitec PDT 630半导体激光治疗仪为光源，用不同浓度的血卟啉衍生物Photosan(0.5、1、2、4 mg/L)作为光敏剂孵育PANC1细胞8 h后，分别给予不同剂量(1、5、10 J/cm2)630 nm激光照射，用MTT法测定PDT后各组的A492值，以流式细胞仪测定10 J/cm2光照后细胞凋亡情况。结果不加光敏剂Photosan或不进行光照，对细胞均无杀伤效应；添加1 mg/L Photosan时，10 J/cm2的光照对细胞产生杀伤效应(0.140±0.013对0.213±0.008，P<0.05)；添加2 mg/L Photosan时，5 J/cm2和10 J/cm2的光照对细胞产生杀伤效应(0.081±0.024和0.049±0.013对0.211±0.031，P<0.05和P<0.01)；添加4 mg/L Photosan时，所有光照剂量均对细胞产生明显的杀伤效应。但5 J/cm2与10 J/cm2光照对细胞的杀伤效应无显著差异。用10 J/cm2光照，0、2、4 mg/L Photosan时的细胞凋亡率分别为(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%，差别具有统计学意义(P<0.05)。结论单纯给予光敏剂或光照对PANC1均不产生PDT效应。光敏剂达到一定浓度，光照达到一定剂量后，PDT效应随其增加而增强。

胰腺肿瘤； 光动力疗法； 血卟啉衍生物； 细胞系

光动力治疗(photodynamic therapy，PDT)是利用光敏剂在特定波长激光照射下产生的光化学反应治疗肿瘤的新技术[1-2]。目前临床主要限于体表、呼吸道和消化道腔内肿瘤的治疗。近年来由于内镜和超声技术的进步使PDT治疗深部脏器肿瘤成为可能。本实验以人胰腺癌细胞系PANC1为对象,应用血卟啉衍生物光敏剂，观察PDT对其的杀伤效应，并初步探讨其机制。

材料与方法

一、MTT 法测定细胞的存活

人胰腺癌细胞株PANC1由中山大学附属第二医院冻存，常规培养传代。取4×103个对数生长期的PANC1细胞接种于96孔培养板培养24 h，弃培养液，每孔分别加入当天用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液稀释的0.5、1、2、4 mg/L的Photosan(德国SeeLab公司，批号940601)溶液100 μl，避光继续培养8 h。弃Photosan的培养液，加入新鲜培养液100 μl/孔后立即给予激光照射，波长630 nm，光照能量为1、5、10 J/cm2，光斑直径为5 cm，光照时间为7 min。每组均设3个复孔。同时设单纯光敏剂组、单纯光照组及空白组。光照后继续培养细胞24 h。每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续孵育4 h，弃孔内培养上清，加100 μl DMSO，恒温振荡10 min。用酶标仪检测各组A492值，取均值。A492值间接反映活细胞数量，并与其成正比。

二、流式细胞术测定细胞凋亡

取对数生长期的PANC1细胞，在3个直径5 cm培养皿各接种2×105个细胞培养24 h。弃培养液，分别加入0、2、4 mg/L浓度的Photosan溶液5 ml，避光继续培养8 h。吸出含Photosan的培养液，加入新鲜培养液5 ml，给予10 J/cm2激光照射，光斑直径为5 cm，光照时间为7 min。照光后继续培养24 h，胰酶消化，离心收集细胞，PBS洗涤3次后将细胞重悬于200 μl 结合缓冲液，加入10 μl Annexin-v-FITC和5 μl PI，混匀后避光室温反应15 min，加入300 μl缓冲液，上流式细胞仪检测。实验重复3次。

三、统计学分析

结 果

一、PDT对PANC1细胞的杀伤效应

不加光敏剂Photosan或不进行光照，对细胞均无杀伤效应。添加0.5 mg/L Photosan时，不同光照剂量对细胞的杀伤无显著变化；添加1 mg/L Photosan时，10 J/cm2的光照对细胞的杀伤效应较0、1、5 J/cm2光照剂量显著增加(P<0.05)；添加2 mg/L Photosan时，5 J/cm2和10 J/cm2的光照对细胞的杀伤效应较1 J/cm2光照剂量显著增加(P<0.05)；添加4 mg/L Photosan时，所有光照剂量均对细胞产生明显的杀伤效应(P<0.01，表1)。Photosan浓度和光照剂量之间既存在交互作用(P<0.05)，又存在独立效应(P<0.05)。但10 J/cm2与5 J/cm2光照对细胞的杀伤效应无显著差异。

表1 人胰腺癌细胞株PANC1经不同浓度Photosan和不同剂量光照后的A492值

注：与0、1 J/cm2和5 J/cm2比较，aP<0.05，与0、1 J/cm2比较，bP<0.05，cP<0.01；与0 J/cm2比较，dP<0.01

二、PDT对PANC1细胞凋亡的影响

光照剂量为10 J/cm2时，0、2、4 mg/L Photosan浓度时的细胞凋亡率分别为(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%，差别具有统计学意义(P<0.05，图1)。

a.0 mg/L Photosan；b.2 mg/L Photosan；c.4 mg/L Photosan

光动力治疗(PDT)是肿瘤治疗领域中的一项创伤小、对肿瘤特异性高的新技术。PDT的基础是光化学或光生物学反应[3]。其原理是利用光敏剂能在肿瘤组织中选择性积聚、潴留的特性，经特定波长的光照，并在氧分子的参与下，使肿瘤组织内的三态氧变为大量有毒的单态氧、羟基团和过氧化基团等，造成细胞中线粒体、溶酶体及核膜、细胞膜的肿胀、破坏，同时产生血栓素，使肿瘤血管栓塞，致肿瘤细胞死亡[4]。

目前有关PDT杀伤肿瘤细胞的研究多集中在体表皮肤肿瘤和腔道肿瘤，如食管癌、支气管肺癌、膀胱癌等，对实体脏器肿瘤方面的报道甚少。随着激光医学、光敏剂和内镜技术的发展，临床PDT治疗胰腺癌将越来越成为可能。本实验选取目前临床上最常用的血卟啉衍生物光敏剂——Photosan，观察不同浓度光敏剂和光照剂量对人胰腺癌细胞株PANC1的杀伤效应。结果显示，单纯给予Photosan或单纯光照，均无PDT效应，说明光敏剂和特定波长的光照都是光动力杀伤肿瘤细胞作用中缺一不可的重要因素，这符合光动力治疗的基本特点[5]。同时也提示，光敏剂或相应波长的激光，并不具备独立的生物学效应，正常组织单独接触时是安全的。

实验结果还显示，当Photosan>1 mg/L、光照剂量>1 J/cm2时才表现出PDT对PANC1细胞的杀伤作用，且随着光敏剂浓度和光照剂量的增加，其杀伤作用亦相应增强，原因可能与细胞对光敏剂的吸收、代谢与排泄的特性以及一定强度的光能量才足以激发光化学反应有关。与陈晓华等[6]对食管癌细胞的PDT研究结果类似。不过，本实验的光照剂量达到5 J/cm2以上后，PDT效应却无显著增加，这可能与细胞存在光照饱和有关。因该剂量的激光已引发光敏剂产生几乎最大程度的光化学反应。

PDT杀伤细胞有两种主要方式：凋亡和坏死。有学者认为，细胞种类、光敏剂的种类及其在亚细胞上的定位、光照剂量是决定此二种方式的主要因素[7]。本实验用最大有效光照剂量10 J/cm2时，细胞的凋亡率随光敏剂浓度的增加而相应增加，提示添加血卟啉衍生物的PDT对PANC1细胞杀伤效应的胞内机制可能与其诱导细胞凋亡有关。

[1] Hamdan KA,Tait IS,Nadeau V,et al. Treatment of grade Ⅲ anal intraepithelial neoplasia wiht photodynamic therapy: report of a case. Dis Colon Rectum,2003,46:1555-1559.

[2] Snyder JW,Greco WR,Bellnier DA,et al. Photodynamic therapy: a means to enhanced drug delivery to tumors. Cancer Res, 2003,63:8126-8131.

[3] 郑积华,王晓怀,张为民,等. 光敏剂Photofrin Ⅱ预激活联合化疗药物对K562细胞杀伤作用的研究. 中国肿瘤临床, 2005,32:493-496.

[4] 漆其光,廖卫国,温清泉.激光动力学治疗早期喉癌的临床分析. 广东医药杂志, 2005,26:962-963.

[5] Sheng C, Pogue BW, Wang E, et al. Assessment of photosensitizer dosimetry and tissue damage assay for photodynamic therapy in advanced-stage tumors. Photochem Photobiol, 2004,79:520-525.

[6] 陈晓华, 罗荣城,李黎波,等. 人食管癌细胞体外光动力效应主要影响因素的实验研究. 南方医科大学学报, 2007,27:1817-1820.

[7] Juzeniene A,Moan J.The history of PDT in Norway.Part one.Identification of basic mechanisms of general PDT. Photodiagnosis Photodyn Ther, 2007,4:3-11.

2009-09-14)

(本文编辑：屠振兴)

Hematoporphyrinderivativephotodynamictherapyofhumanpancreaticcancercellsinvitro

YUZhong,HUANGKai-hong,WANGLing-yun,ZHUZhao-hua,CHENRu-fu,ZHANGJin-xin.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

ZHUZhao-hua,Email:zhuzhaoh@mail.sysu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the killing effect of hematoporphyrin derivative photodynamic therapy (PDT) on cultured human pancreatic cancer cell, and to explore the mechanism of this effect.MethodsBiolitec PDT 630 semi-conductor laser therapeutic apparatus was used as the light source. After pancreatic cancer cell PANC1 was incubated 8 h with different concentrations of Photosan (hematoporphyrin derivative) as photosensitizer (0.5mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L), the cells were given different doses of 630nm laser irradiation (1 J/cm2,5 J/cm2,10 J/cm2). TheA492value was determined in each group with MTT method. Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry after PDT.ResultsThere was no killing effect when no Photosan was administrated; 10 J/cm2irradiation had killing effect on PANC1 when Photosan was administrated as 1 mg/L(0.140±0.013vs0.213±0.008,P<0.05) ; 5 and 10 J/cm2irradiation all had killing effect on PANC1 when Photosan was administrated as 2 mg/L (0.081±0.024 and 0.049±0.013vs0.211±0.031,P<0.05 andP<0.01); all doses of irradiation had killing effect when Photosan was administrated as 4 mg/L. There was no significant difference between 5 and 10 J/cm2irradiation in term of killing effect. Cell apoptosis rates with 0 or 2 or 4 mg/L Photosan and 10 J/cm2irradiation were (13.8±1.8)%,(40.9±1.6)%, (62.5±2.0)%, the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionsPhotosensitizer or irradiation alone did not produce PDT effect. With certain dose of photosensitizer and irradiation, the PDT effect increased accordingly.

Pancreatic neoplasms; Photodynamic Therapy; Hematoporphyrin derivative; Cell line

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.011

广东省自然科学基金(06021369) 广东省医学科研基金(B2006043)

510120 广州，中山大学附属第二医院消化内科(于钟、黄开红、王凌云、朱兆华)，外科(陈汝福)；中山大学医学统计与流行病学系(张晋昕)

朱兆华，Email:zhuzhaoh@mail.sysu.edu.cn