刚地弓形虫蛋白质分拣定位与功能研究概述

赵世云,计永胜,孙希萌,索 勋

(中国农业大学动物医学院,北京海淀100193)

刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种专性细胞内寄生原虫,可以感染包括人在内的所有温血动物的有核细胞。如今,刚地弓形虫病已成为影响公共卫生的重要的人畜共患病：世界人群的刚地弓形虫慢性感染率约为25%,在法国和巴西,人的刚地弓形虫血清阳性率甚至高达75%～80%,我国各地人群弓形虫感染率从0.13%到47.13%不等。刚地弓形虫具备精密而复杂的细胞入侵、细胞内分裂和逸出机制。在这3个过程中,刚地弓形虫的各种蛋白质起着举足轻重的作用。因此,刚地弓形虫的蛋白质合成、分拣和分泌机制逐渐成为寄生虫学研究的热点之一。这些研究既可以更好的揭示刚地弓形虫的致病机理,又可以为其他寄生虫研究,如疟原虫,提供理论上的借鉴。本文主要阐述的是刚地弓形虫虫体内外蛋白质的分拣与分泌定位研究进展。

1 刚地弓形虫虫体内蛋白分拣机制研究进展

对弓形虫体内蛋白早期分泌路径进行分析后发现,弓形虫对组成型及调节蛋白分泌的分拣机制与高等真核细胞具有多重类似点[1]。定位到微线、棒状体和致密颗粒3种细胞器中的蛋白质经核糖体合成后都要通过信号肽识别进入内质网,并在高尔基体完成加工修饰,最终定位到虫体的不同部位。研究发现,GPI-锚定的蛋白(如SAGs)通过组成型分泌小泡靶向运输到虫体细胞膜;微线蛋白则可能受酪氨酸胞浆信号基序的介导从反-高尔基体网中得以分拣,并在钙离子信号刺激下释放后固定于虫体表面;棒状体蛋白主要储存于非成熟棒状体(类似真核生物中非成熟分泌颗粒,经加工修饰后成为成熟棒状体),通过管道释放,最终定位于带虫空泡膜;致密颗粒蛋白的释放可能是通过致密颗粒表面蛋白与虫体胞膜蛋白的融合。释放出的致密颗粒蛋白多呈可溶性,分布于带虫空泡腔的网状结构和带虫空泡膜。这些刚地弓形虫体内蛋白不同定向是由蛋白自身携带的次级信号肽决定的。对棒状体蛋白ROP1的研究就证明,ROP1的蛋白前体片段对它向棒状体的定位起着决定性作用[2]。而对于致密颗粒蛋白GRA5来说,其N端序列则决定着它向致密颗粒定位的命运。

2 刚地弓形虫虫体外蛋白定位机制研究进展

我们知道,刚地弓形虫入侵细胞只需要不到30 s的时间。纵然在这一瞬间,刚地弓形虫的蛋白释放同样具有时序性：微线首先在虫体与宿主细胞接触时释放微线蛋白形成活动连接体,使虫体与宿主细胞紧密结合,最近研究表明,棒状体颈蛋白(RON)也参与活动连接体的形成;随后是棒状体蛋白(ROPs)的释放,这些蛋白最终对带虫空泡膜进行修饰;最后释放的是致密颗粒蛋白(GRAs),它们既可以保持原有的可溶状态,也可以对带虫空泡膜及带虫空泡腔内网状结构进行修饰。刚地弓形虫主要蛋白及定位功能见表1。

弓形虫蛋白质在宿主细胞的定位机制目前存在不同的解释模型。一说弓形虫在入侵到宿主细胞的瞬间会将某些蛋白质,尤其是棒状体蛋白注入到宿主细胞浆中,同时形成一个不含虫体的空泡结构(evacuoles)。与带虫空泡相似,这种泡状结构同样可以募集宿主的细胞器,如内质网。随着弓形虫的进一步入侵,这种泡状结构逐渐与带虫空泡表面融合,使先前存在于宿主胞浆的弓形虫蛋白定位到带虫空泡表面[3]。有研究也证明,在入侵过程中,弓形虫会将致密颗粒蛋白GRA7在带虫空泡形成前以丝状或者念珠状形式分泌到宿主细胞,同时,这种蛋白还可以和棒状体蛋白 ROP2和 ROP4相互结合[4]。所以,从某种意义上讲,刚地弓形虫在入侵宿主细胞时只是暂时将自身蛋白释放到宿主细胞浆,最后还是要将这些蛋白招募回来供自己使用。这样既可以避免被宿主细胞的免疫递呈系统发现,也可以保持自身活力。然而,最近的研究也发现,刚地弓形虫同样可以“大胆”地将蛋白持续释放到宿主的细胞浆。典型的例子就是Toxofilin蛋白,该蛋白可以与宿主细胞肌动蛋白结合[5],在弓形虫入侵细胞32 h后仍存在于宿主细胞浆中,但敲除该基因并不影响弓形虫正常生物学特性[6]。除此之外,刚地弓形虫甚至可以将自身蛋白分泌定位到宿主细胞的细胞核中,例如蛋白磷酸酶 2C(PP2C-hn)[7]和rop16[8]。两者均具有核定位基序,前者可以与Toxofilin结合,并将 Toxofilin带到宿主细胞核。但奇怪的是,PP2C-hn的敲除只是对刚地弓形虫的生长产生微弱的影响。Toxofilin和PP2C-hn的具体功能还需要进一步研究。

刚地弓形虫入侵细胞后会形成一个带虫空泡,限制了虫体与宿主之间蛋白信息的交换,因为这层膜结构仅允许不大于1 300 Da的蛋白自由穿过。迄今为止,带虫空泡膜的具体形成机制仍需要确凿试验数据阐明,带虫空泡膜表面蛋白的定位机制也是科学家的研究重点之一。有报道,在GRA5[9]和GRA6[10]的定位中,其N端氨基酸序列起着决定性的作用。ROP18蛋白也能牢固地定位于带虫空泡膜,同样其接近N端的氨基酸序列对其定位有重要作用。寻找影响蛋白质定位的保守氨基酸序列将有助于更清晰地阐明虫体外蛋白的分泌机理。

表1 刚地弓形虫主要蛋白及其功能

3 刚地弓形虫虫蛋白功能研究进展

近些年,许多研究小组在分析弓形虫蛋白分泌、定位的基础上,把研究重点转移到棒状体(ROPs)和致密颗粒蛋白(GRAs)的功能上。其中,ROP2蛋白家族是多种棒状体分泌蛋白的集合。其家族成员ROP2可以募集宿主细胞的线粒体到带虫空泡膜表面,可以参与虫体向宿主攫取营养物质的过程。研究还证明,Ⅰ、Ⅲ型弓形虫在某些棒状体蛋白分泌上存在差异,较为经典的是ROP18和 ROP16蛋白。Ⅰ型弓形虫的ROP18的分泌量远大于Ⅲ型弓形虫,虫体杂交试验、基因组数量特征座分析及转基因弓形虫试验联合证明ROP18可提高虫体的增殖分裂速度及对感染动物的致死作用,是弓形虫的一种毒力因子[11]。近年研究发现,具有丝氨酸/苏氨酸磷酸化活性的ROP18可以将ROP2与ROP8蛋白磷酸化,并发生自身磷酸化[12]。但这种分布于带虫空泡膜的蛋白质对宿主细胞的生物学影响仍有待研究。另一种具有磷酸化功能的ROP2蛋白家族成员是ROP16。Ⅱ型弓形虫的ROP16基因序列与Ⅰ型、Ⅲ型存在较大差异(后两者可认为相同)。这种差异直接造成不同型弓形虫感染对宿主细胞细胞因子IL-12分泌的影响不同。有数据显示,II型弓形虫感染的人包皮纤维母细胞(HFF)IL-12分泌量大大高于另外两型[8]。这种影响是通过ROP16干涉宿主细胞STAT3信号传导实现的,但详细作用机制仍需进一步研究阐明。科学家从GRA6、GRA4和ROP7上找到了针对BALB/c小鼠H-2Ld限制性CD8+T细胞的抗原表位[13-14]。有科研人员也从tgd057蛋白上找到了针对H-2Kb组织相容复合体限制性抗原表位[15]。

4 结语与展望

刚地弓形虫作为一种重要的人畜共患病,一直受到科研人员的重视。一个世纪以来,科学家从分类形态学、诊断学、治疗学及分子生物学等方面对弓形虫作了研究[16]。然而,一些挑战,尤其是分子生物学方面的难题仍然摆在大家面前：弓形虫入侵宿主细胞的蛋白质基础,包括受体的分类与细胞内信号传导,这将很好的解释为何刚地弓形虫可以感染所有有核细胞;棒状体蛋白不同定位的内在机制,这种分拣完成与带虫空泡形成的时间先后及棒状体蛋白的跨膜运输机制仍需详细阐明;3种特殊细胞器中蛋白质的抗原性存在差异,这有助于弓形虫优势抗原的筛选;弓形虫与宿主细胞的对话机制,可能更好的解释弓形虫的免疫逃避机制,为研发更加有效的弓形虫病治疗药物提供理论基础。因此,随着新理论、新技术的不断涌现,刚地弓形虫的研究必然会取得更加好的成果。

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