屠宰猪肝脏中乙型肝炎病毒的PCR检测与电镜观察

刘利强,杜 娟,佘锐萍,李文贵

(1.河北工程大学农学院,河北邯郸056021;2.中国农业大学动物医学院,北京海淀100193;3.云南农业大学动物科学学院,云南昆明650201)

HBV为乙型肝炎(hepatitis B,HB)的病原体,是目前已知的最小动物DNA病毒之一。HBV属嗜肝DNA病毒科,同属该科的还有土拨鼠肝炎病毒、地松鼠肝炎病毒、鸭乙型肝炎病毒、树松鼠乙型肝炎病毒等 。HBV 与WHV、GSHV、DHBV的核苷酸同源性分别为70%、55%、40%[1]。这些病毒均具有相似的形态结构,表现为3种颗粒：小球形颗粒、长管形颗粒与有双层结构内含核酸成分的病毒颗粒。这些病毒在生物学及分子生物学特性方面也有类似之处,均为双链环形DNA病毒,但其双链环形并不完整,其中有长链与短链之分。已有的研究表明,在家畜和家禽中也存在类乙肝样病毒群。自20世纪80年代以来,国内有关猪、鸡、牛、羊、犬等动物检出乙肝病毒表面抗原(HBsAg)的报道,有的还分离到类乙肝病毒[2-9]。HB严重地威胁着人类的健康,而人类的乙型肝炎的发病率还在不断上升。动物,尤其是与人类关系十分密切的猪体内的HBV带毒情况如何,它们与人的HBV是否具有同源性等等问题,尚不清楚。本研究在已有的基础上,应用PCR技术和透射电镜技术,对屠宰猪肝脏的HBV S基因进行检测,利用电镜观察乙型肝炎病毒颗粒。

1 材料与方法

1.1 材料 猪肝脏采自北京市某肉联厂。

1.2 酶与试剂 Taq酶、dNTP购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司;引物订自上海生工生物工程技术服务有限公司;NCRquick柱式DNA凝胶回收试剂盒购自新长江生物科技有限公司;pMD18-T载体为宝生物工程(大连)有限公司产品。其他化学试剂为分析纯。

1.3 HBV PCR检测

1.3.1 核酸提取 取新鲜肝组织标本称重约2 g,加液氮研成粉末,取约20 mg加入DNA提取液(0.5 mmol/LTris-HCl,0.02 mol/L EDTA,10 g/LSDS,0.01 mol/L NaCl,500μg/mL蛋白酶K)42℃～48℃过液,酚/氯仿/异戊醇法提取DNA。

1.3.2 PCR扩增 采用针对HBV S基因保守区设计的引物(表1)进行PCR扩增。PCR体系：10×PCR 缓冲液 2.5μL,引物 HBV-FP、HBV-RP 各0.5 μL,200 μmol/L dNTP 0.5 μL,Taq 0.5 μL(2.5 U),加灭菌水补足至25μL。扩增条件：预变性94℃4 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃40 s,30个循环;72℃延伸5 min。10g/L琼脂糖凝胶电泳,紫外灯观察结果,照相。

表1 检测屠宰猪肝脏中HBV的引物

1.3.3 PCR产物的克隆和测序 采用NCR quick柱式DNA凝胶回收试剂盒回收扩增片段,将其克隆至pMD18-T载体,鉴定后送北京奥科生物技术有限责任公司测序,用 DNAman(version5.2.2,Lynnon biosoft)分析测序结果。

1.4 电镜样品的制备 肝脏经多聚甲醛-戊二醛双重固定后,修块,漂洗,1%锇酸固定,漂洗,经30%,50%,70%,80%,90%,95%,100%,100%丙酮各10 min脱水,干燥,包埋,切片,染色,JEM-1230型透射电镜观察。

2 结果

2.1 PCR检测结果 从屠宰猪肝脏中提取DNA,应用HBV S基因区引物进行PCR扩增,产物大小约为300 bp,与预期的281 bp相符(见图1)。

图1 屠宰猪肝脏中HBV PCR检测电泳结果

2.2 PCR产物的测序结果 对扩增的片段进行测序,结果发现,所扩增区域与 GenBank中 hbv_25Y07hcc和hbv_26Y08hcc毒株的同源性达99.05%(见图2)。

2.3 电镜观察 在屠宰猪肝脏样品的超薄切片中可以看到,在胞核内球形病毒样粒子,散在排列,未见丝状和管状体(图3)。根据大小不同,这些病毒样粒子主要可分为2种类型,一种直径为40 nm左右(图3圆形箭头所示),与人类HBV的Dane颗粒相类似;另一种直径为20 nm左右(图3箭头所示),类似于人类HBV的小球状粒子。

3 讨论

目前,国外还未见畜禽体内感染 HBV的相关报道,而关于动物乙肝病毒的检测,国内已有一些报道,但有关屠宰猪体内乙肝病毒的检测少有报道。国内现有的研究多采用HBV检测试剂进行血清标志物和相关抗原的检测,也有人对其形态和S区基因等进行了研究,但对于家畜尤其是猪体内的HBV分子病毒学、与人HBV之间的关系等的研究还很少。本试验在过去观察研究的基础上,应用PCR技术和透射电镜技术对屠宰猪肝脏中HBV抗原进行了检测。本试验对编码HBV最为保守的HBsAg的S区引物进行了扩增,从屠宰猪肝脏中检测出了预期片段,序列分析结果表明,与HBV同源性高达99.05%。丁壮[6-8]等在羊、鸡、犬血清中以人乙肝病毒S基因两侧的保守区域作为模板,采用套式PCR方法分别扩增出羊源、鸡源、犬源乙肝病毒S基因,序列分析结果表明,扩增的乙肝病毒与人乙肝病毒在S基因上核苷酸序列有很大的同源性,同源性为98%以上,氨基酸序列同源性为95%以上。李文贵[10]等在猪血清样品中应用HBV S基因区引物进行PCR扩增,所得产物的序列与GenBank中HBV的同源性达100%。本试验扩增出的目标片段序列分析结果也表明了屠宰猪体内HBV与人HBV在S基因区上具有非常高的同源性。由于本试验所测定序列较短(S基因区全长约1 185 bp),占S区基因的23%左右,占HBV全基因组的9%左右,不能进行全基因序列比较,但在一定程度上说明了猪HBV与人HBV有较高的同源性。

图2 屠宰猪肝脏中HBV扩增片段与hbv_25Y07hcc和hbv_26Y08hcc株序列的同源性比较

图3 电镜下观察到的猪HBV颗粒

人乙肝患者的肝脏和血清中HBV在电镜下呈3种形态的颗粒,其中一种是40 nm的球形颗粒,亦称为Dane颗粒,是完整的病毒粒子,具有传染性;另一种是直径20 nm左右的小球形颗粒被认为是病毒增值过程中剩余的产物,不具有传染性;还有一种长管形颗粒,也无传染性。本试验中在透射电镜观察下发现,在肝脏样品中存在有形态、大小与人HBV Dnae颗粒和小球状颗粒相似的病毒粒子,散在呈小团块状分布。

现有的研究表明,动物的乙肝病毒对人没有危害性,不会引起人的疾病,但经肉类食品进入人体后是否可以引起相应的人体的免疫反应,是否能增强人体内的HBV的毒力等等问题现在还不清楚。我国约有10%人为乙肝病毒携带者,这么高的感染率是否与猪乙肝病毒存在一定的关系,值得进一步深入研究。

[1] 余传霖,熊思东.分子免疫学[M].上海：复旦大学出版社,2001：843-871.

[2] 沈柏青,任政华.猪源乙型肝炎病毒样病毒的提纯与鉴定[J].黑龙江畜牧兽医,1993(7)：7-9.

[3] 律祥君,侯安祖.黄牛感染人乙型肝炎的研究初报[J].中国人兽共患病杂志,1993,9(4)：34-35.

[4] 李决,王秉清,蔡金环,等.PCR检测鸡类乙型肝炎病毒的研究[J].郑州牧业工程高等专科学校学报,1994(3)：1-4.

[5] 杜念兴,黄吉凤.从猪和牛检出类乙肝病毒抗原和抗体[J].畜牧与兽医,2002,34(1)：3-5.

[6] 丁壮,金宁一.鸡源类人乙肝病毒与人乙肝病毒S基因序列分析[J].中国兽医学报,1999,19(1)：18-21.

[7] 丁壮,金宁一,陈创夫,等.羊源乙肝病毒与人乙肝病毒S基因序列同源性研究[J].动物医学进展,2001,22(4)：54-58.

[8] 丁壮,王承宇,金宁一,等.犬乙肝病毒 S基因遗传变异研究[J].中国预防兽医学报,2003,25(1)：24-28.

[9] 佘锐萍,李文贵,王英华,等.病毒性肝炎--值得警惕的重要人兽互传病[J].科技导报,2007,25(4)：44-52.

[10]李文贵,佘锐萍,韦海涛,等.屠宰猪肝和血清中乙型肝炎病毒及戊型肝炎病毒的检测[J].中国兽医科学,2007,37(11)：921-925.