磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的药代动力学研究

林丽聪 樊海平 廖碧钗 余培建 钟全福

(福建省淡水水产研究所 福建福州 350002)

磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的药代动力学研究

林丽聪 樊海平 廖碧钗 余培建 钟全福

(福建省淡水水产研究所 福建福州 350002)

在(25±1)℃水温条件下,以300 m g/kg的单剂量,给欧洲鳗鲡混饲口灌磺胺嘧啶后,用高效液相色谱法测定血浆和肌肉中的药物浓度,研究了磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的药代动力学特征。结果表明:欧洲鳗鲡血浆和肌肉中磺胺嘧啶经时过程均符合一级吸收二室开放模型,其理论方程为:C血浆=196.16e-0.0308t+44.028e-0.0067t-7.9584e-0.0871t,血浆中药物主要动力学参数如下:T1/2ka为7.9584h;T1/2a为22.473h;T1/2β为104.27h;Tmax为21.512h;Cmax为100.51m g/L。C肌肉=0.077e-0.061t+34.545e-0.015t-3.8399e-0.181t,肌肉中主要动力学参数如下:T1/2ka为3.8399h;T1/2a为11.277h;T1/2β为46.210h;Tmax为15.762h;Cmax为25.024m g/kg。以20μg/kg为最高残留限量计算,在本试验条件下,建议磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的休药期不低于48d。

欧洲鳗鲡;磺胺嘧啶;高效液相色谱;药代动力学

1 前言

磺胺类药物是目前国内水产领域使用程度仅次于抗生素的药物,对水产养殖中细菌性竖鳞病、烂鳃病、弧菌病、疖疮、赤鳍病、肠炎、鞭毛虫病有良好的防治效果,因而得到了广泛应用[1]。该类药物在人体内的作用时间和代谢时间较长,当蓄积浓度超过一定量时将对人体机能产生损害,引起过敏、泌尿系统和造血系统功能紊乱等不良反应[2]。近年来,日本、欧盟等主要进口国对水产品的质量安全要求越来越严格,日本肯定列表中将动物源性食品的磺胺类残留总量最低限量定为20μg/kg;欧盟2377/90/EEC中也明确规定,在所有动物源性食品中磺胺类残留总量不能超过100μg/kg;农业行业标准NY5070-2002中规定磺胺类在水产品中总量不得超过100μg/kg。在我国地标升国标渔药目录中,磺胺嘧啶已成为国标渔药。鳗鲡是我国出口水产品的重要品种之一,目前未见有关磺胺嘧啶在鳗鲡体内的药动学和残留的研究报道,因而深入研究磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的分布、残留与代谢规律,将为磺胺嘧啶的残留检测工作和临床使用技术的制定提供理论基础。

2 材料与方法

2.1 实验动物

健康欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla),由福建省福清三华饲料有限公司提供,平均体重150±20g,试验前暂养在水泥池中60d,正常投饵换水管理,水温为18～28℃。试验在50cm×80cm不锈钢水族箱中进行,每箱放水200L,放鳗鲡25尾,不间断冲气增氧,不投饵,水温控制在(25±1)℃。试验前鳗鲡经抽查证明组织中均不含磺胺嘧啶。

2.2 药品及试剂

磺胺嘧啶标准品:含量99.9%,由中国兽医药品监察所提供;磺胺嘧啶原料药:含量98%,购自重庆西南合成药业;乙腈:HPLC级;其它试剂均为分析纯。?

2.3 高效液相色谱仪及色谱条件

采用Agilent 1200型高效液相色谱(HPLC)仪(色谱柱类型:Eclipse XDB-C184.6×250mm 5μm);多波长紫外检测器;流动相:乙腈:0.05M磷酸二氢铵(20:80,V/V);流速:0.8 mL/min;柱温:室温;紫外检测波长:270nm;进样量:50μL。

2.4 试验设计及采样

称取磺胺嘧啶原料药适量于200mL容量瓶中,加入未加淀粉的鳗鱼基础饲料,加水配置成含磺胺嘧啶400mg/mL的糊状液。按300mg/kg单剂量口灌给药,无回吐者保留实验。给药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、5、8、12、24、32、48、72、120、240、480、720、1080、1440h分别采集鱼体的血液、肌肉,每个采样时间点采鱼样5尾。血液置于含少量1%肝素钠(已风干)离心管中混匀,5000 r/min离心5min分离血浆,血浆、肌肉于-80℃保存备用。

2.5 样品处理

2.5.1 血浆

取出冷冻保存的血浆样品,室温下自然解冻,准确吸取1mL置于15mL具塞塑料离心管中,加入3mL甲醇,漩涡混合5min,5000r/min离心5min,吸取上清液转移到另一15mL具塞塑料离心管中;重复1次,合并上清液,于50℃氮气吹干,残余物加1mL流动相溶解,离心,过0.45μm滤膜,取50μL上机检测。

2.5.2 肌肉

将肌肉样品匀浆,准确称取2.0g于50mL离心管中,加入4mL10%硫酸钠和6mL乙腈:氯仿(10:1),漩涡混合5min,5000r/min离心5min,吸取上清液转移到1支15mL具塞塑料离心管中;残渣再加4mL乙腈:氯仿(10:1),重复操作1次,合并上清液,于50℃氮气吹干,残余物加2mL流动相溶解后,加4mL流动相饱和的正己烷去脂1次,下层液过0.45μm滤膜,取50μL上机检测。

2.6 标准曲线的制备

准确称取磺胺嘧啶标准品10mg于25mL容量瓶中,加乙腈制成400μg/mL的标准储备液,4℃避光保存备用,临用前用流动相稀释成系列标准工作液。称取5份空白样品(血浆或肌肉)分别加入标准工作液适量,配制成含磺胺嘧啶为0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/L的血浆样品和0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mg/kg的肌肉样品,然后按照1.5方法对样品处理后,上机测定其峰面积,求出血浆和肌肉的标准工作曲线回归方程和相关系数。

2.7 回收率和精密度

取空白样品,添加适量磺胺嘧啶标准工作液,配制成含磺胺嘧啶为0.05、0.1和0.5mg/L 3个系列浓度的血浆样品和0.05、0.1和0.5mg/kg 3个系列浓度的肌肉样品,按1.5方法对样品处理后,用高效液相色谱仪测定,计算回收率。

将上述不同浓度的样品于ld内分别重复进样5次和分5d测定,计算日内精密度和日间精密度。

2.8 模型及参数的确定

将欧洲鳗鲡血浆与肌肉中磺胺嘧啶浓度-时间数据(C-T)用PKS药动学分析程序在微机上进行药动学处理,给出药物代谢所符合的模型和参数。

3 结果

3.1 磺胺嘧啶标准品及样品的色谱行为

在上述色谱条件下,磺胺嘧啶的色谱峰尖锐且对称,标准品和样品保留时间均为5.6min左右。样品中虽有杂峰出现,但与药物目标峰分离良好;空白血浆和肌肉中均无磺胺嘧啶峰。见图1。

3.2 标准曲线及最低检测限

在0.05～2.0mg/L线性范围内,欧洲鳗鲡血浆和肌肉中磺胺嘧啶的回归方程和相关系数见表1。从表1可知,在此线性范围内,磺胺嘧啶在血浆和肌肉中线性关系良好。以引起3倍基线噪音的药物浓度为最低检测限,该方法的最低检测限为5μg/L,满足磺胺嘧啶的残留分析要求。

表1 欧洲鳗鲡血浆和肌肉中磺胺嘧啶的线性回归方程及相关系数

图1 磺胺嘧啶色谱图

3.3 回收率及精密度

分别对3种不同质量浓度的磺胺嘧啶在血浆和肌肉中的回收率及精密度进行测定,结果见表2。由表2可知,血浆中平均回收率为(87.18±1.85)%,日内精密度为1.28%、日间精密度为3.58%;肌肉中平均回收率为(79.49±3.83)%,日内精密度为2.03%、日间精密度为3.12%。说明该方法准确度高,重复性好,符合药物代谢动力学研究要求。

表2 欧洲鳗鲡血浆和肌肉中磺胺嘧啶的回收率及精密度(n=5)

3.4 磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的浓度变化及代谢动力学特征

以300m g/kg单剂量口灌给药后,药物在血浆中吸收、分布、消除速率均较肌肉中慢,达峰时间长,峰浓度值高。将磺胺嘧啶浓度-时间数据采用PKS药动学程序进行分析,根据A IC值最小和R2值最大的原则,判定欧洲鳗鲡单剂量口灌磺胺嘧啶后血浆及肌肉中的药物经时过程均符合一级吸收二室开放模型,其理论方程为:C血浆=196.16e-0.0308t+44.028 e-0.0067t-7.9584 e-0.0871t;C肌肉=0.077e-0.0615t+34.545 e-0.0150t-3.8399e-0.1805t。药时曲线见图2,详细药动学参数见表3。

图2 欧洲鳗鲡口灌磺胺嘧啶(300m g/kg)后血浆和肌肉中的药时曲线

表3 磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的药代动力学参数

4 讨论与结论

4.1 磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的药代动力学特征

比较磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡血浆和肌肉中的浓度变化,磺胺嘧啶在血浆和肌肉中的变化趋势基本一致,只是在不同时间段各组织内药物浓度各有高低。磺胺类药物在组织中有一个较为特殊的代谢过程,称为乙酰化(即磺胺类药物与乙酰辅酶A结合生成无活性的代谢产物乙酰化磺胺),磺胺类药物通过这一途径的代谢速度很快。Sam uelsen等[3]报道了SDM、S M Z、S M 2、SGD 4种磺胺类药物在大西洋鳙鲽(H ippog lossus h ippog lossus)肌肉内的乙酰化率分别为93%、89%、11%、9%;以200m g/kg浓度水浴72h后测得以上4种药以及T M P在肌肉内的最高浓度分别为2.1、6.1、24.4、32.6、99.0μg/mL。说明乙酰化率的高低与药物在组织中的浓度大小有很大关系。Sam uelsen等[4]研究了SDM在大西洋鲑体内的代谢清况,结果显示SDM在血液、肌肉、肝脏、肾脏4种组织中浓度分别为14.3、17.7、7.4、6.8μg/m L;认为乙酰化是SDM在大西洋鲑体内代谢的主要途径。本研究血浆中的药物浓度与肌肉内的药物浓度相比始终保持较高水平,这可能与磺胺类药物的乙酰化使其在肌肉中浓度较低有关,具体情况还有待进一步研究。

磺胺嘧啶在血浆及肌肉的代谢过程中,其药物浓度均出现两次出峰的现象,原因可能是某些脏器对药物存在再吸收[5],比如肝肠循环的作用,使得药物二次吸收,浓度升高。这种现象在日本学者烟井等[6]测定氯霉素在鱼血液中含量,测定磺胺在虹鳟鱼血浆中浓度时都出现过。李美同等[7]进行土霉素在鳗鲡体内的残留研究时也发现由于再吸收引起肝中药物浓度二次升高的现象。

4.2 磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡体内的残留及休药期

磺胺嘧啶在欧洲鳗鲡血浆和肌肉中的消除半衰期分别为104.27h和46.210h,说明磺胺嘧啶在肌肉中消除较血浆中要快。日本《食品中残留农药肯定列表制度》中规定鳗鲡目中磺胺嘧啶的最高残留限量(MRL)为20μg/kg。若根据食用组织中残留浓度来确定休药期,则第21d就可以达到要求,而血浆中则需48d才达到要求。为了充分保障消费者的安全,选择肌肉中未检测出药物且血浆中药物浓度低于20μg/kg的时间为可以起捕食用的时间。因此初步建议在(25±1)℃水温条件下,以300 m g/kg单剂量对欧洲鳗鲡混饲口灌给药,休药期至少为给药后48d,起捕食用才是安全的。由于药物在体内的消除受许多因素的影响,因此,休药期的制定应结合给药方式、投饵量、养殖管理方式等多方面因素,本研究结果可作为一个重要的参考数据。

[1] 王群,马向东,李绍伟.HPLC法研究磺胺类药物在水产动物体内的代谢和残留[J].科技瞭望,1999,(6):33～36.

[2]李孟玻,张德云,彭之见,等.高效液相色谱法测定鱼肉中残留磺胺类药物[J].理化检验:化学分册,2006,42(8):611～613,619.

[3]Samuelsen O B,Lunestad B T,JelmertA.Pharmacokinetics and efficacy studies on bath-administering potentiated Sulphonamides in Atlantic halibut Hippogl-ossus hippoglossus[J].Fish D is,1997,20:287～290.

[4]Samuelsen O B,PurseⅡL,Smith P,et al.Multiple-dose Pharmacokinetics study of Romet30 in A tlanticsalmon(Salmosalar)and in vitro antibacterial activity against Aeromonas[J].Aquaculture,1997,152:287～296.

[5] 冯淇辉.兽医抗菌药物代谢动力学研究[M].北京:农业出版社,1987:50～120.

[6] 田中二良著.刘世英等译.水产药详解[M].北京:农业出版社,1982:58～87.

[7] 李美同,郭文林等.土霉素在鳗鲡组织中残留的消除规律[J].水产学报,1997,21(1):39～43.

Pharmacokinetics of Sulfadiazine in European eels(Anguilla anguilla)

Lin Licong,Fan Haiping,Liao Bichai,Yu Peijian,ZhongQuanfu
(The Fresh water Fisheries Research Institute of Fujian Province,Fuzhou,Fu jian,350002)

In order to study the pharmacokinetics of Sulfadiazine(SD)in European eels(Anguilla anguilla),the eels were treated orally with Sulfadiazine-blended feeds at a single dose of 300m g·kg-1bodyweight at water temperature of(25±1)℃.The SD concentrations of p las m a and muscle were determined by high perform anceliquid chromatography(HPLC).The results show ed that both the plasma and muscle concentration-time course of SD conform ed to a two-compartment open model with the first order absorption.The pharmacokinetic equations were as follow s:Cplasma=196.16e-0.0308t+44.028 e-0.0067t-7.9584e-0.0871t,the main pharmacokinetic parameters were:T1/2kawas 7.9584h;T1/2a,22.473h;T1/2β,104.27h;Tmax,21.512h;Cmax,100.51m g·L-1.Cmuscle=0.077e-0.061t+34.545e-0.015t-3.8399e-0.181t,the main pharmacokinetic parameters were:T1/2kaw as 3.8399h;T1/2a,11.277h;T1/2β,46.210h;Tmax,15.762h and Cmaxwas 25.024m g·kg-1.According to the maximum residual limit(MRL)of 20μg·kg-1,the with drawl period should no t be less than 48 days under this experiment condition.

Anguilla anguilla;Sulfadiazine;High Performance Liquid Chromatography(HPLC);Pharmacokinetics

S965.223 S859.7

公益性行业(农业)科研专项资助项目(nyhyzx07-043-10);福建省海洋与渔业厅专项资金资助项目(2009001)