黄原胶降解菌的筛选及紫外诱变选育

易绍金，李炳金，胡 凯（长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州434023）

黄原胶降解菌的筛选及紫外诱变选育

易绍金，李炳金，胡 凯（长江大学化学与环境工程学院，湖北 荆州434023）

从土壤中筛选出一株能以黄原胶为唯一碳源的黄原胶降解菌（XDB－1菌株），研究表明该菌株能在36h内将黄原胶的粘度降至最低（＜5mPa·s）。对该菌株进行不同强度（时间）的紫外诱变，以提高菌株降解黄原胶的性能，最终选育出一株更高效的黄原胶降解菌（XDB－2菌株），紫外诱变后的菌株（XDB－2菌株）能在24h内使黄原胶的粘度降至最低（＜5mPa·s）。

黄原胶降解菌；降粘；紫外诱变；筛选

黄原胶是由野油菜黄单孢菌分泌的中性水溶性多糖，其工业产品外观为淡褐黄色粉末状固体。由于黄原胶具有独特的剪切稀释性质、良好的增粘性、理想的乳化稳定性，对酸、碱、热、反复冻融的高度稳定性以及对人体的完全无毒无害等许多优良的特性，使其在石油、食品、医药、日用化工等十几个领域有着极其广泛的应用［1］。超乎寻常的稳定性极大地扩展了黄原胶的应用范围，但同时在应用中也存在一些问题。在钻井、压裂施工完成后，其中所含的增粘剂——黄原胶，必须及时降解破胶，以防止堵塞油层而影响油气生产。而常用的化学破胶方法虽然能降解黄原胶，但低温破胶效果差，同时存在安全、环保隐患。笔者从土壤中筛选出一株可有效降解黄原胶的菌株，并对其进行紫外诱变选育以获得更为高效的菌株，为钻井、压裂过程中黄原胶的生物破胶奠定了基础。

1 试验材料

1.1 菌种来源

试验菌种来自与黄原胶长期接触的土壤，以工业黄原胶为唯一碳源，经常规分离得到［2，3］。

1.2 培养基

选择性培养基［4］：K2HPO4·3H2O（1.0g）＋K2H2PO4（1.0g）＋NH4NO3（1.0g）＋黄原胶（5.0g），定容至1L，调pH值为7.0；121℃灭菌18min。

平板培养基［5］：黄原胶（3.0g）＋酵母浸膏（1.0g）＋蛋白胨（1.0g）＋葡萄糖（1.0g）＋琼脂（20.0g），定容至1L，调pH 值为7.0；115℃灭菌20min。

基础培 养 基［2］：K2HPO4·3H2O（1.0g）＋ K2H2PO4（1.0g）＋ NH4NO3（1.0g）＋ NaCl（5.0g）＋MgSO4·7H2O（0.2g）＋黄原胶（5.0g）＋无水CaCl2和FeCl3（微量），定容至 1L，调pH值为7.0；121℃灭菌18min。

试验中若无特殊说明，所涉及的液体培养基均为基础培养基。

1.3 试验方法

黄原胶降解菌计数法［5］：试验采用浊度法间接反映黄原胶降解菌的浓度，即测定黄原胶溶液在600nm处的吸光值（OD600）。OD600的大小与细菌浓度的高低呈正比例关系，OD600值越大，表明细菌浓度越高；OD600值越小，表明细菌浓度越低。

黄原胶溶液粘度测定方法［6］：采用ZNN－D6A型六速旋转粘度仪测定25℃时的黄原胶溶液粘度。

2 黄原胶降解菌的筛选

2.1 黄原胶降解菌的分离、筛选

经常规分离得到一组能以黄原胶为唯一碳源并使其粘度降低的细菌——黄原胶降解菌，选择降解速度最快、降粘效果最好的菌株进行试验。试验步骤如下：①配制选择性培养基，在250ml的三角锥形瓶中装入100ml，灭菌后，将所采集的与黄原胶长期接触的土样取10g，研细后分别加入上述10个锥形瓶中，搅拌使土样悬浮均匀，在30℃、120r/min的气浴恒温振荡器中培养，观察黄原胶粘度变化；②当黄原胶的粘度明显降低后，取1ml混合液，按1∶10的比例进行梯度稀释，将稀释好的菌液按1ml的量加入到灭菌的平板培养皿中，在30℃生化培养箱中培养48h，长出单个菌落；③挑取单个菌落分别接种于液体培养基中，在30℃、120r/min的气浴恒温振荡器中培养，观察培养基粘度变化；④选取黄原胶粘度降低（＜5mPa·s）最快的一株菌种（该菌株命名为XDB－1菌株）进行菌种保藏，并进行后续试验。

2.2 黄原胶降解菌的生长及降粘效果

将XDB－1菌株按5%的接种量接种到黄原胶液体培养基中，置于30℃、120r/min的气浴恒温振荡器中培养，每隔一段时间测定其粘度和OD600值，得到粘度和OD600的变化曲线如图1所示。

图1 XDB－1菌株对黄原胶粘度及溶液OD600的影响

由图1可以看出，开始阶段（前12h）XDB－1菌液浓度几乎没有变化，12h后菌浓度迅速增大，48h菌浓度趋于稳定，48～72h，菌浓度几乎不变，之后菌浓度逐渐降低。而黄原胶粘度在前12h几乎没有变化，12～36h之间粘度迅速降至最低（＜5mPa·s）；之后则几乎没有变化。这表明，黄原胶粘度的降低与XDB－1菌株的生长基本同步，黄原胶粘度的降低是XDB－1菌株的作用所致。

3 黄原胶降解菌的紫外诱变选育

3.1 诱变选育的目的

由于筛选出的XDB－1菌株对黄原胶的作用时间相对较长，在油田实际应用中还存在一定的局限。试验试图通过紫外诱变，筛选出能在更短时间内能有效降解黄原胶的菌株［7］。

3.2 紫外诱变选育方法

紫外诱变选育的方法如下：①将筛选出的XDB－1菌株在液体培养基中培养36h后，按1∶10的比例进行梯度稀释，将稀释好的菌液按1ml的量加入到灭菌的培养皿中，然后分别在紫外灯（15W，20cm）下暴露0.5、1、2、3、5和10min。将经过紫外线照射的培养皿按常规方法涂黄原胶平板，放入30℃生化培养箱中培养。②待平板培养48h后，分别挑出其中形状不同的菌落的一部分接种于黄原胶斜面培养基，在30℃恒温生化培养箱培养48h长出菌苔，置于冰箱保存；另一部分接种于液体培养基，在30℃、120r/min的气浴恒温振荡器中培养，观察培养基粘度变化。③选取黄原胶粘度降低（＜5mPa·s）最快的一株菌（该菌株命名为XDB－2菌株）进行菌种保藏，并进行后续试验。

3.3 选育菌株的生长及降粘效果

将诱变后的XDB－2菌株按5%的接种量接种到黄原胶液体培养基中，置于30℃、120r/min的气浴恒温振荡器中培养，间隔一段时间测定其粘度和OD600值，得到粘度和OD600的变化曲线如图2所示。

图2 XDB－2菌株对黄原胶粘度及OD600的影响

由图2可以看出，开始阶段（前8h）XDB－2菌液浓度几乎没有变化，8～32h菌浓度迅速增大，32h后菌浓度几乎不变，48h菌浓度逐渐降低。而黄原胶粘度在前8h几乎没有变化，8～24h之间粘度迅速降至最低（＜5mPa·s），之后粘度几乎没有变化。这表明，黄原胶粘度的降低与XDB－2菌株的生长基本同步，黄原胶粘度的降低是XDB－2菌株的作用所致。对比图1、图2可以看出，诱变前后细菌在黄原胶液体培养基中都能很好地生长，但与诱变前的XDB－1菌株相比，诱变后的XDB－2菌株降解黄原胶的速度明显加快（从36h缩短为24h）。

4 结 论

1）黄原胶作为一种生物聚合物，具有可生物降解性，能从自然界中筛选出有效降解黄原胶的细菌，这为黄原胶生物破胶提供了可能。

2）通过室内试验筛选出一株能有效降解黄原胶的细菌（XDB－1菌株），试验表明它能在36h内将黄原胶液体培养基的粘度降至最低（＜5mPa·s）。而通过进一步的紫外诱变，筛选出一株能在24h有效降解黄原胶使其粘度降至最低（＜5mPa·s）的菌株（XDB－2菌株）。与XDB－1菌株相比，XDB－2菌株使黄原胶降粘所需时间由36h缩短为24h。这对于加快黄原胶的生物降解，进而应用于含黄原胶的钻井液、压裂液的低温生物破胶，具有重要意义。

［1］易绍金，佘跃惠.石油与环境微生物技术［M］.武汉：中国地质大学出版社，2002.204～216.

［2］易绍金，熊汉辉，王丰.黄原胶降解菌的生长规律及影响因素［J］.钻井液与完井液，2007，24（6）：69～71.

［3］熊汉辉，易绍金，王丰.黄原胶降解菌的降粘作用研究［J］.钻井液与完井液，2007，24（5）：62～64.

［4］Cadmus M C，Jackson L K，Burton K A，et al.Biodegradation of xanthan gum by Bacillus sp［J］.Applied and Environmental Microbiology，1982，44（2）：5～11.

［5］韩秋惠，李冲伟，王梅，等.新分离M icrobacteriumsp.XT11菌产黄原胶降解酶生产条件的优化研究［J］.生物技术通报，2006，（增刊）：469～475.

［6］黄成栋，王洪荣，白雪芳，等.黄原胶降解菌的筛选及其降解酶性质的研究［J］.微生物学通报，2005，32（1）：32～37.

［7］郭继平，马莺.紫外诱变选育米曲霉高产蛋白酶菌株［J］.微生物学通报，2007，34（2）：246～250.

Selection and Ultraviolet Mutagenesis of Xanthan－degrading Bacterial

YI Shao－jin，LI Bing－jin，HU Kai（College of Chemistry and Environmental Engineering，Yangtze University，Jingzhou434023，Hubei，China）

A bacterium（XDB－1strain）which could degrade xanthan gum effectively was selected from soil.The research shows that this xanthan－degrading bacterial can take xanthan gum as the only carbon source.The bacterial can reduce the viscosity of xanthan fluid to the lowest level（＜5mPa·s）within 36hours.Also，place the bacterial under ultraviolet ray to improve its xanthan－degrading activity.Ultimately，the most effective bacterium（XDB－2strain ）is selected.Within 24hours，the xanthan－degrading bacterial after mutagenesis can reduce the viscosity of xanthan fluid to the lowest level（＜5mPa·s）.

xanthan－degrading bacterial；viscosity reduction；ultraviolet mutagenesis

TE357.9

A

1000－9752（2010）05－0118－03

2010－01－11

教育部重点实验室资助项目（K200610）。

易绍金（1963－），男，1984年大学毕业，教授，现主要从事石油与环境微生物和油气田环境保护教学与科研工作。

［编辑］ 萧 雨