急性冠脉综合征患者辅助性T细胞亚群的变化及意义
2010-11-15席新龙袁祖贻程曼丽纪玉强杨小波西安交通大学医学院第一
赵 朝,席新龙,袁祖贻,刘 艳,程曼丽,纪玉强,杨小波 (西安交通大学医学院第一
附属医院心内科,西安 710061;2西安市第一医院心内科;*通讯作者,E-mail:zuyiyuan@mail.xjtu.edu.cn)
急性冠脉综合征(ACS)是严重危害冠心病患者健康的重大问题,包括不稳定性心绞痛(unstable angina,UA)和急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI),通常是由于易损斑块的纤维帽破溃,血栓形成,管腔堵塞引起,免疫细胞尤其是T淋巴细胞在其中发挥着重要的作用[1,2]。既往研究显示斑块的稳定性和T细胞的数量密切相关,T细胞少经常与稳定性斑块伴随,易损斑块内含较多的T细胞[3]。动物实验表明下调辅助性T细胞(Th)亚群1(Th1)的反应或阻断其效应分子可以减轻动脉粥样硬化(AS)的发生和发展,同时使斑块的稳定性增加,提示T淋巴细胞与急性冠脉综合征的关系密切[4]。本研究拟通过对ACS患者外周血单个核细胞(PBMC)中Th1/Th2的分析,进一步探讨Th细胞在ACS中的作用。
1 对象与方法
1.1 研究对象 收集2009-04~2009-10在西安交通大学第一附属医院心内科住院的患者92例,按WHO冠心病的诊断标准分为急性心肌梗死(AMI)组、不稳定性心绞痛(UA)组和稳定性心绞痛(SA)组。AMI的诊断标准为缺血性胸痛和肌酸激酶同工酶(CK-MB)或肌钙蛋白I(TnI)升高2倍以上;UA组为入院前48 h内出现过静息性胸痛,有一过性的ST段水平或下斜性压低和/或T波倒置,无CK-MB或TnI升高2倍以上,冠状动脉造影至少有1支血管直径狭窄>50%;SA为符合加拿大心血管协会SAⅡ级或Ⅲ级标准,冠状动脉造影显示至少有1支血管直径狭窄>50%。对照组为年龄和性别匹配的同期住院的冠状动脉造影所有的血管直径狭窄<50%及临床症状排除冠脉痉挛的住院患者。
排除标准:6个月以内的心肌梗死、缺血性胸痛到抽血时间超过24 h、心房颤动、心瓣膜病、急性炎症反应和自身免疫性疾病、肝肾疾病、血液系统疾病及服用免疫抑制剂。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂及仪器 佛波酯(PMA)和离子霉素(ionomycin)购自Calbiochem公司;多甲藻叶绿素蛋白(Percp)标记的 CD4抗体、异硫氰荧光素(FITC)标记的IFN-γ抗体、异藻青蛋白(APC)标记的IL-4抗体、同型对照为FITC标记的IgG1和APC标记的IgG1、莫能霉素(monensin)和FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司)。RPMI1640培养液购自Gibco公司,总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司;DNA荧光染料(SYBR GreenⅡ)购自TaKaRa公司,引物由TaKaRa公司合成。
1.2.2 常规检查 血脂、心肌酶和肌钙蛋白均为入院常规检查。
1.2.3 人外周血单个核细胞的分离 所有观察对象均于住院次日清晨空腹抽取静脉血5 ml,肝素抗凝。用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。PBS液洗2次,分为2份,一份用3 ml RPMI1640培养液重悬,用于流式细胞分析;一份用于实时定量PCR。
1.2.4 流式细胞术检测 Th1/Th2细胞频率 PBMC 培养液中加入 PMA(50 μg/L)、ionomycin(500 μg/L)和 monensin(0.67 ml/L),37 ℃,5%CO2孵箱中孵育4 h,收集PBMC,PBS液洗1遍,将细胞数调整为2 ×106/ml。加入 20 μl CD4-PerCP 抗体,4 ℃孵育30 min。PBS液洗1次,加入250 μl固定/破膜液(美国BD公司),4℃孵育20 min。用1 ml破膜/洗液洗涤2次,重悬后平均分为检测管和对照管,按照说明书检测管依次加入IFN-γ-FITC和IL-4-APC抗体,对照管加入各自的同型对照抗体,室温避光孵育30 min,破膜/洗液洗2次,流式细胞仪检测。用前向散射光(FSC)及侧向散射光(SSC)圈出淋巴细胞,以CD4+细胞设门,每一样品检测1×104个细胞。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测PMBC的IFN-γ、T-bet、STAT4、IL-4和 GATA3的 mRNA 表达 ①总RNA的提取:1 ml Trizol试剂裂解细胞,提取总RNA。②逆转录反应:应用Fermentas逆转录试剂盒在温度梯度PCR仪进行逆转录反应得到cDNA,合成的cDNA于-80℃冰箱保存备用。③引物的设计与合成:扩增引物序列见表1。④实时荧光定量PCR:配置20 μl反应体系在IQ5荧光定量PCR仪上扩增目的基因,反应条件为95℃ 10 s预变性;95℃ 5 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 10 s,共 40 个循环,2-△△CT计算转录水平差异。
表1 实时定量PCR的引物序列Tab 1 Primers used in real-time PCR
1.3 统计学分析 CK、CK-MB、TnI用中位数和极差表示,其余数据以±s表示,用SPSS11.5软件进行统计分析。CK、CK-MB、TnI和 mRNA水平不符合正态分布,用Mann-WhitneyU检验,病人一般资料和细胞频率符合正态分布和方差齐性检验,采用单因素方差分析,计数资料组间差异的比较用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料 各组患者年龄、性别、高血压、吸烟、糖尿病和血脂的比较均未见统计学差异,AMI组较UA、SA组和对照组的CK、CK-MB、TnI显著升高(P<0.01,见表2)。
表2 各组患者一般资料的比较Tab 2 Clinical characteristics of patients and normal controls
2.2 各组Th1和Th2细胞频率的比较 UA和AMI组患者Th1(IFN-γ/CD4+T)细胞频率较SA组和对照组显著升高(P<0.01,见图1)。各组间Th2(IL-4/CD4+T)细胞频率变化无统计学差异(P>0.05,见表3)。
图1 各组Th1/Th2细胞频率的比较Fig 1 Comparison of Th1/Th2 cell frequencies among 4 groups
表3 各组Th1/Th2细胞频率的比较 (%)Tab 3 Comparison of frequencies of Th1/Th2 cell among four groups(%)
2.3 各组Th1和Th2相关基因mRNA水平的比较UA和AMI组患者Th1相关基因IFN-γ、T-bet和STAT4的mRNA水平较SA组和对照组显著升高(P<0.01)。各组间 Th2细胞相关基因 GATA3和IL-4的mRNA变化无统计学差异(P>0.05,见表4)。
表4 各组Th1/Th2细胞相关基因mRNA水平的比较Tab 4 Comparison of mRNA expression of Th1/Th2 related gene expression among four groups
3 讨论
动脉粥样硬化是动脉血管壁的慢性炎症反应,T淋巴细胞对AS斑块的形成和不稳定斑块的破溃均起重要的作用[5,6]。有研究表明易损斑块内T细胞较多,稳定性斑块内的T细胞较少。T细胞根据其在免疫应答中的功能不同分为辅助性T细胞(Th)、细胞毒性T细胞(Tc)和调节性T细胞(Tr),动物研究中表明它们均参与了AS不稳定斑块的形成[7,8]。为了进一步明确辅助性T细胞亚群在急性冠脉综合征中的可能作用,本实验通过流式细胞术检测外周血循环中Th1/Th2细胞,结果显示ACS患者中Th1细胞的频率较SA患者和对照显著增高,而各组患者Th2细胞频率无明显变化,提示ACS患者存在Th1/Th2细胞功能失衡。
Th按分泌细胞因子的不同至少分为Th1和Th2两群。Th1细胞主要分泌 IFN-γ,T-bet和STAT4是Th1细胞分化和IFN-γ分泌的关键核转录因子;Th2细胞主要分泌IL-4,GATA3是Th2细胞分化必需的核转录因子。已有研究证实阻断IFN-γ或T-bet不仅可以减轻AS斑块的进展,而且使斑块内胶原合成增加,使斑块更趋于稳定[9,10]。本研究通过实时荧光定量PCR检测4组患者PBMC的Th1和Th2细胞相关因子IFN-γ、T-bet和STAT4、IL-4和GATA3的mRNA水平,发现Th1细胞相关因子IFN-γ、T-bet和STAT4的mRNA水平在ACS患者中明显升高,而Th2细胞相关因子IL-4和GATA3的mRNA水平在各组之间并无统计学差异,进一步证实了ACS中存在Th1细胞的过度激活。尽管Th1细胞过度激活促发ACS的机制尚不明确,但可能与Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ抑制血管平滑肌细胞增殖、减少胶原合成以及促进基质金属蛋白酶的分泌,使纤维帽变薄有关[1]。临床研究表明,血清IFN-γ浓度升高的患者,心梗、中风和死亡率更高[11],进一步提示,Th1细胞的活化可能与 ACS发生密切相关。
本实验研究结果中Th1细胞的频率和相关因子的转录水平在SA和对照组患者并无明显的差异,与以往的研究结果有出入[12],可能的原因是以往研究的对照组选自健康查体者,而本研究的对照组是经冠脉造影检查排除冠心病,但在冠心病危险因素如年龄、性别、高血压、吸烟、糖尿病、血脂异常等方面与冠心病组匹配,而这些因素本身可能增强了Th1亚群的反应。但是,与SA患者和对照相比,ACS患者Th1亚群细胞比例和相关因子的转录水平仍显著增高,提示ACS对Th1亚群的影响远超出年龄、性别、吸烟、高血压、糖尿病及血脂异常等因素的影响,使Th1细胞反应增强。
因此,尽管我们尚不能确定Th1/Th2细胞功能失衡是不稳定斑块破溃的使动因素,但Th1/Th2细胞失衡加剧了机体的全身以及斑块局部炎症反应,这可能会使纤维帽变薄变弱,导致斑块破溃,促进急性冠脉综合征的发生。
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