黑胡椒抑菌活性物质提取工艺优化

陈文学，胡月英，葛 畅，张 鑫，蒋志国，李从发

（海南大学食品学院，海南海口570028）

黑胡椒抑菌活性物质提取工艺优化

陈文学，胡月英，葛 畅，张 鑫，蒋志国，李从发*

（海南大学食品学院，海南海口570028）

为了研究黑胡椒中抑菌活性物质的提取工艺，以黑曲霉做指示菌，以提取率×抑菌圈直径为活性追踪指标，在单因素实验的基础上通过二次回归通用旋转组合设计进行工艺参数优化。结果表明，其最佳提取工艺条件为：乙醇浓度80%，浸泡时间480min，提取时间100min。

黑胡椒，抑菌，黑曲霉

胡椒（Piper nigrum L.），藤本植物，属胡椒科，由胡椒科植物的球形浆果干制加工而成，带黑色果皮者称为黑胡椒。1947年引入中国海南［1-2］，然后在广东、云南、广西、福建等省区也陆续引种试种成功。胡椒种植业现已作为海南省的一项产业，不仅基本满足了国内市场对胡椒的需要并且还有部分出口［3］。胡椒在食品工业和医药工业上具有很多用途，在食品工业中，胡椒是一种优良的食品调味剂和食用香料［4］，并且具有防腐作用，被广泛用作腌制品的防腐性香料；在医药工业上，它可提取胡椒碱，胡椒林碱，胡椒油碱甲、乙、丙等生物碱和挥发油，还可将其加入药材使用，有镇静，温中散寒、下气、健胃、止痛、消炎、解毒、降血脂等功能［6-7］，可治疗消化不良症、寒痰、积食、肠炎、支气管炎、感冒和风湿病等。胡椒在抗惊厥，杀虫，抗癌等多方面存在活性［8］。近年来的研究表明［9-13］，黑胡椒中抗癌前体化合物毕澄茄素（多环氧木脂素类化合物）对于1，2-二甲基肼（一种结肠致癌物）所引起的结肠癌有抑制作用。胡椒的乙醇提取物对常见食品污染菌有较强的抑制作用；胡椒挥发油对动物和植物病菌、腐败菌均有抑制效果。由此可见，从黑胡椒中提取抑菌活性物质作为天然无污染的食品防腐剂具有非常好的经济前景和研究前景。目前国内外学者对胡椒的抑菌作用已有部分研究，但国内关于这一方面的研究还较少，本文主要研究胡椒对黑曲霉的抑菌作用，并对黑胡椒中抑菌活性物质的提取工艺进行优化，以期为进一步开发利用这一丰富的植物资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

黑胡椒 购自百佳汇超市中兴店；黑曲霉菌种海南大学食品学院微生物实验室提供；培养基马铃薯蔗糖琼脂培养基。

超声波清洗机 广州经济技术开发区明珠电器有限公司；电热恒温水浴锅 北京市医疗设计厂；数显恒温水浴锅、旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；循环水式真空泵 巩义市英峪予华仪器厂；生化培养箱 南京实验仪器厂；电热恒温鼓风干燥箱 上海跃进医疗器械厂；立式压力蒸汽灭菌器 上海医用核子仪器；电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 将黑胡椒置于50～60℃非鼓风烘干1d，待冷却后，粉碎，过40目筛，取筛下物留作样品。

1.2.2 抑菌实验方法 平板打孔法是固体平板扩散法的其中一种，可以在平板上打一定大小的圆孔，然后把被测物滴入孔内。经培养后在物质扩散所及的范围内出现抑菌圈（或生长圈），测量圈的直径，即可知道被测物的抑菌能力［14］。每个平板中加入适量培养基，冷却后加入0.3mL菌悬液［15］涂布均匀，然后用直径为11mm的打孔器打孔，吸取0.1mL样品溶液注入已打好的圆孔中（以95%乙醇为空白），于37℃下培养24h，测抑菌圈直径。

抑菌圈直径（mm）=样品抑菌圈直径-空白抑菌圈直径

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 不同提取工艺对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响 在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后加入100mL 95%乙醇，浸泡240min后分别用超声波提取法和回流提取法［16］提取60min。提取结束后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后称重并计算提取率。

1.2.3.2 溶剂浓度对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响 在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后分别加入100mL 95%乙醇，80%乙醇，60%乙醇，40%乙醇，水，浸泡240min后黑胡椒用回流法提取60min。提取结束后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后备用。

1.2.3.3 提取时间对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响 在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后加入100mL 95%乙醇100mL，浸泡240min后，用超声波法提取，分别以20、40、60、80、100、120min提取。提取结束后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后备用。

1.2.3.4 浸泡时间对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响 在250mL三角瓶中加入5.000g样品，然后加入100mL 95%乙醇100mL，分别浸泡0、240、480、720、960min，然后用超声波法提取60min后用真空泵抽滤，然后置于60℃水浴锅中浓缩蒸干，冷却后备用。

1.2.4 黑胡椒抑菌活性物质的提取工艺参数优化根据以上单因素实验结果，分别将溶剂浓度、浸泡时间、提取时间对抑菌效果的综合影响，采用DPS数据处理系统设计三因素二次通用旋转组合实验设计，对黑胡椒进行工艺优化。实验结果分析均在DPS数据处理软件下运行，编码因子见表1。

表1 二次通用旋转组合设计因子水平表

2 结果与分析

2.1 不同提取工艺对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响

不同提取工艺对提取效果及抑菌效果的影响如表2所示。经过Duncan法比较发现，黑胡椒用回流法和超声波法提取在提取率上无显著性差异；在抑菌圈直径上两者存在显著性差异，回流法的抑菌效果更好。通过比较两者提取的提取率及抑菌圈直径效果，故黑胡椒选择用回流法提取。

表2 黑胡椒不同提取工艺的提取效果及抑菌效果

2.2 溶剂浓度对黑胡椒提取率及抑菌效果的影响

溶剂浓度对提取率及抑菌效果的影响如图1所示。由图1可知，随着溶剂浓度的逐渐增大，黑胡椒提取液提取率也随之增大，当溶剂浓度增加到一定程度时，增加趋势有所减缓；当乙醇浓度达到95%时，黑胡椒提取液抑菌效果最好。根据相似相溶原理，说明95%乙醇溶液较适合黑胡椒中抑菌物质的提取。

图1 溶剂浓度对黑胡椒的提取率及抑菌效果的影响

2.3 提取时间对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响

提取时间对提取效果及抑菌效果的影响如图2所示。由图2可知，抑菌活性总体呈现先增大后减小趋势，当提取时间为60min时提取效果及抑菌效果均达到最佳。当提取时间小于60min时，回流处理时间较短暂，黑胡椒中提取物因溶剂效应有利于其溶解，并且随着提取时间的延长，黑胡椒中的抑菌物质的提取率增大，所以抑菌活性也逐渐增大；而当时间超过60min时，回流处理时间较长，影响了抑菌物质的活性，对提取效果产生了波动，当提取时间为60～120min之间，在100min又出现一个峰值。

图2 提取时间对黑胡椒的提取效果及抑菌效果的影响

2.4 浸泡时间对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响

浸泡时间对黑胡椒抑菌活性物质提取效果及抑菌效果的影响如图3所示。由图3可知，随着黑胡椒浸泡时间的延长，提取率总体呈递增的趋势，抑菌效果呈先增后减的趋势，当浸泡时间在0～720min时，随着时间的延长，黑胡椒中抑菌活性物质的提取因溶剂效应有利于其溶解，使抑菌效果在720min时达到最大值，抑菌圈直径达到了6.96mm。但当时间超过720min时，由于乙醇随时间的延长缓慢挥发或其他原因，使整个溶剂系统极性发生变化。所以抑菌效果呈下降趋势。

图3 不同浸泡时间对黑胡椒的提取效果及抑菌效果的影响

2.5 黑胡椒抑菌活性物质提取工艺参数及优化

根据以上单因素实验结果表明，溶剂浓度、浸泡时间、提取时间等对黑胡椒抑菌活性物质的提取均具有不同程度的影响。因此采用二次通用旋转组合实验设计对提取工艺进行了优化，实验结果见表3。实验结果分析均在DPS数据处理软件下运行。

表3 黑胡椒的二次通用旋转组合设计方案及结果

采用DPS7.0及SAS8.2对黑胡椒对黑曲霉抑菌效果进行回归分析得到以下回归方程，实验结果的方差分析见表4。其回归方程如下：

对胡椒抑菌提取的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏回归系数进行检验，结果（表4）表明：一次项中X2的偏回归系数显著，说明浸泡时间对提取率×抑菌圈直径效果有显著影响；X1、X3的偏回归系数极显著，说明溶剂浓度、提取时间对提取率×抑菌圈直径效果有极显著影响；交互项的偏回归系数X1X3显著，说明溶剂浓度和提取时间的交互项对胡椒提取效果有显著影响；二次项中的偏回归系数达极显著水平，其他各项的偏回归系数均未达到显著水平。

表4 黑胡椒活性提取物对黑曲霉抑菌效果的实验结果方差分析

采用频率分析法寻找最优工艺。对数学回归模型进行频率分析得到的结果见表5，在95%的置信区间的优化方案为：溶剂浓度81%～86%，浸泡时间367～512min，提取时间70～81min。

表5 优化提取方案中Xi取值频率分布

以提取率×抑菌圈直径为准，将其回归方程用LINGO语言进行分析，得到最佳方案为：乙醇浓度为80%，浸泡时间480min，提取时间100min。对最佳方案进行验证，得到提取率×抑菌圈直径为88.0516，与理论值的87.1148相差不大，所以可认为其为最佳方案。

3 结论

3.1 通过二次通用旋转组合实验设计建立了黑胡椒抑菌活性物质提取的溶剂浓度、浸泡时间、提取时间3个因素的回归方程，此模型在实验范围内能较准确地预测黑胡椒抑菌活性物质的提取效果。

3.2 3个因素对白胡椒抑菌活性物质的提取效果的影响大小顺序为：溶剂浓度＞提取时间＞浸泡时间。

3.3 通过二次通用旋转组合实验设计获得了黑胡椒抑菌活性物质的最佳提取工艺参数为：黑胡椒用80%乙醇溶液提取，浸泡时间 480min，提取时间100min时对黑曲霉具有最佳的抑制效果。

3.4 大量研究表明，广泛存在于植物中的酚酸类化合物具有抗细菌和抗真菌的性能［17］。K.J.Pradhan从青胡椒浆果中分离得到两个酚类化合物，即3，4-二羟基苯乙醇葡萄糖苷及3，4-二羟基6（N-乙胺基）苯甲酰胺A、B两种物质［18-19］，对伤寒沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，蜡状芽孢杆菌和大肠杆菌等有较强的抑制作用［20］。

本文是对黑胡椒抑菌活性物质的提取工艺进行了优化，今后的研究中一方面采用HPLC/MS或者HPLC/MS/MS对黑胡椒提取物中主要的抑菌活性成分进行定性定量分析，另一方面加强对黑胡椒抑菌活性物质的应用研究，并且在进一步的分离纯化的基础上，将其应用到肉类的保鲜中去。胡椒经乙醇提取后制成天然防腐剂，不仅可取代对人体健康有一定影响的化学合成防腐剂，而且对人体无害且有一定的医疗保健作用，同时还赋予食品独特的香味，可满足人们对天然食品、绿色食品、健康食品的需要。

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Optimization technology for extracting antibacterial substances from black pepper

CHEN Wen-xue，HU Yue-ying，GE Chang，ZHANG Xin，JIANG Zhi-guo，LI Cong-fa*
（College of Food Science and Technology，Hainan University，Haikou 570028，China）

ln order to investigate the technology for extracting antibacterial substances from black pepper，Aspergillus niger was used as indicator bacteria，extraction rate and diameter of inhibition zone were used as the activity monitoring parameter.The optimum extraction conditions were obtained by quadratic general rotary unitized design.The results showed that the optimum extraction conditions were 80%ethyl alcohol as extraction，immersed 480min and extracting 100min.

black pepper；antibacterial activity；Aspergillus niger

TS201.1

B

1002-0306（2010）11-0279-04

2009-11-09 *通讯联系人

陈文学（1968-），男，副教授，主要从事热带农产品加工的教学与科研工作。

十一五国家科技支撑项目（2007BAD76B04）；海南省自然科学基金（808102）；海南省教育厅基金（Hj2009-25）；海南大学校科技基金资助（hd09xm90）。