纳豆枯草芽孢杆菌生物发酵川穹嗪初探

刘晓杰，章海锋，陈继承，翁育辉，陈启和，何国庆

（浙江大学食品科学与营养系，浙江杭州310029）

纳豆枯草芽孢杆菌生物发酵川穹嗪初探

刘晓杰，章海锋，陈继承，翁育辉，陈启和*，何国庆

（浙江大学食品科学与营养系，浙江杭州310029）

据资料显示，纳豆芽孢杆菌具有生物合成川穹嗪（TMP）等吡嗪类物质的特性，但并未深入展开研究。本文考察了液体发酵培养和固体发酵过程中底物乙偶姻（ACT）的加入时间、乙偶姻添加量及种子液的加入量对TMP生物合成的影响。实验结果表明，液体培养基组成为20%大豆浸泡物、0.5%乙偶姻时最有利于TMP的合成；固体发酵过程中，当前体在培养84h时加入TMP的合成量最高，TMP产率随底物乙偶姻加入量的增加而增加，与种子液的加入量呈负相关。关键词：川穹嗪，纳豆，乙偶姻，生物合成

川穹嗪，即四甲基吡嗪（tetramethypyrazine，TMP），分子式C8H12N2，分子量136.20，无色针状结晶，熔点80～82℃（显微鉴别）、沸点190℃，具有特殊异臭，有吸湿性，易升华，易溶于热水、石油醚，溶于氯仿、稀酸，不溶于冷水，是从川穹总生物碱中分离出来的一种具有多种生物活性的酰胺类生物碱，临床上广泛用来治疗心血管疾病［1］。其作用机制在于川穹嗪可以改善血液流变性、防止血栓形成，影响内皮素和一氧化氮含量，抑制钙超载，抗自由基损伤，影响凋亡相关基因和细胞因子［2］。近年来研究发现，川穹嗪还可以调节干预抑制肺泡巨噬细胞（PAM）核因子（NF-KB）活化，减轻失血性休克并内毒素诱发的急性肺损伤；在异体肾移植后减轻肾小球病理损害及保护肾功能；对兔高眼压视神经轴突起保护作用，对慢性高眼压下视网膜神经节细胞和双极细胞具有保护作用；拮抗心力衰竭时心房纤维化及心房颤动的发生；治疗支气管哮喘及免疫调控；对四氯化碳诱导的大鼠实验性肝纤维化有明显的保护和治疗作用［1］。目前，溶剂法是获得川穹总提物最常用的一种方法。该法是将药材粉碎后，用有机溶剂（一般为乙醇）浸泡后，多次回流提取，提取液过滤浓缩后，再流经大孔吸附树脂柱，收集30%乙醇洗脱液，得到川穹总提取物［3-4］。尽管该法工艺成熟，但作为川穹嗪的主要获取方式，川穹中0.1%～0.2%的含量仍不能很好地满足人们在科研、制药等方面的需求。尽管川穹嗪在化学合成方面已经获得许多进展，但损耗大、化学残留高、安全性不高等因素限制其在实际中应用。纳豆是大豆经发酵制成的日本传统食品，其特征成分甲基吡嗪（MPs）的种类和含量备受关注［8-9］。因此通过微生物发酵合成研究纳豆芽孢杆菌合成川穹嗪的合适方式和条件，以拓展纳豆的功效，为工业化生产高TMP活性的纳豆提供理论指导和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

大豆 市售；葡萄糖、天冬氨酸、基础氮源 购自国药集团化学试剂有限公司，纯度为分析纯；乙偶姻、TMP标准品 99.9%纯度，均购自Sigma公司；菌种 纳豆芽孢杆菌B.subtilis Natto由本实验室保藏。

Technologies 1200Series液相色谱仪 Agilent；色谱柱 ZORBAX SB-C18（4.6×100mm，1.8μm）；LDIX -4011型立式蒸汽灭菌消毒器 上海中安医疗器厂；LRH-150生化培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆液体发酵方法 液体发酵培养基的配制见表1所示。

表1 液体发酵的培养基组成（pH 7.3～7.5）

在37℃进行发酵转化，接种量为2%，发酵摇床转速200r/min，在500mL摇瓶中装量为150mL，转化3d后取样提取分析。

1.2.2 大豆固体发酵工艺流程 大豆的固体发酵流程采用的是纳豆生产工艺，具体流程如下：

精选的大豆→洗净→浸泡→煮大豆→摊凉→接种发酵→放置后熟→成熟纳豆

固体发酵步骤：大豆经流水浸泡24h；三角瓶封装100g/瓶；立式蒸汽灭菌器121℃灭菌20min；接种（接种量为5%，m/v）；培养3～4d；加前体物乙偶姻，继续培养。

1.2.3 发酵样品的处理 采用溶剂提取方法进行萃取，5g样品+25mL三氯甲烷超声波提取1h，加25mL 0.2mol/L盐酸萃取，同时进行快速分析。

1.2.4 ACT、TMP同步HPLC检测条件 流动相：1%醋酸水溶液∶甲醇=45%∶55%，0.5‰三氟乙酸；流速：1.0mL/min；检测波长：290nm；柱温：45℃；进样量：2μL；跑样时间：10min。

1.2.5 标准曲线的制作 不同梯度TMP标准品的溶液配制：0.2、4、8、12、16、20、40、80μg/mL。TMP标准溶液的线性关系考察：以TMP浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标作图，得回归方程y=5.901x-1.725，R2=0.999934。

不同梯度乙偶姻标准品的配制：0.05、1、2、3、4、5、10、20mg/mL乙偶姻标准溶液的线性关系考察：以乙偶姻浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标作图，得回归方程y=26.5x-1.48，R2=0.999944。

2 结果与讨论

2.1 液体发酵对大豆转化合成TMP的影响

不同发酵方式对大豆原料转化合成TMP的影响具有明显不同差异，其中对不同处理方式和前体添加对转化合成TMP的影响进行了深入探讨，实验结果见图1。

图1 大豆液体发酵不同处理方式对ACT、TMP的影响

从图1结果可以看出，8号培养基对TMP合成具有显著促进效果。与9号培养基相比，是否添加前体对TMP合成具有显著影响。从图中结果也可以看出不同培养基组成对ACT利用率影响的差异。

2.2 固体发酵方式对纳豆芽孢杆菌合成TMP的影响

2.2.1 底物加入时间对TMP产率的影响 以下所有大豆接种发酵的时间均为144h，图表中的X轴代表加入底物的不同时间。底物添加量为200μg/瓶100g，种子液接入量2%。从图2中结果可以看出，底物于纳豆发酵84h后添加最有利于纳豆中TMP的合成。

图2 底物加入时间对TMP合成量的影响

2.2.2 底物加入量对TMP产率的影响 为了考察ACT不同添加量对纳豆中TMP合成的影响，本部分主要研究了几种添加量对TMP合成量的差异，底物乙偶姻的加入时间为发酵开始的84h，接种量为2%。实验结果见图3，从图3结果可以看出，添加量提高，其TMP合成的量也随之升高，在实验设计的范围内具有线性关系。从这些研究数据不难看出，ACT和TMP合成之间存在着必然的关系，而且这种关系在一定程度内是线性的，线性回归方程y=4.4428x-7.3039，R2=0.822。

图3 底物加入量对TMP合成量的影响

2.2.3 纳豆芽孢杆菌接种量对TMP合成的影响 本部分考察了纳豆发酵中不同接种量对TMP合成影响，以探讨纳豆芽孢杆菌是否对TMP合成产生必然影响。前体乙偶姻的添加时期为发酵84h，添加量为200μL/100g。实验结果见图4所示，从图中结果不难分析，1%的接种量为纳豆产TMP的合适菌量，当然这个接种量并不一定是其最佳加量，还有待深入研究和探讨。

图4 纳豆芽孢杆菌接种量对TMP合成量的影响

3 结论

3.1 液体发酵实验结果表明，底物乙偶姻的添加对纳豆芽孢杆菌发酵产TMP有重要影响，发酵培养基以20%大豆浸泡物、0.5%天冬氨酸、2%葡萄糖对底物乙偶姻的合成最为有利。以20%大豆浸泡物、0.5%乙偶姻最有利于TMP的合成。

3.2 固体发酵实验表明，当底物乙偶姻的加入量为200μg/100g黄豆、接种量为2%、在培养84h时加入TMP的合成量最高，产率为12.809μg/g黄豆。

3.3 固体发酵TMP的产率随底物乙偶姻加入量的增加而增加，当乙偶姻的加入量为500μg/100g黄豆时，TMP产率为18.525μg/g黄豆。

3.4 固体发酵当乙偶姻的加入量为200μg/100g黄豆，底物加入时间为84h时，TMP产率为与种子液的加入量呈负相关，当接种量为 1%时，产率为9.221μg/g黄豆。

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A pilot study on the biological synthesis of methypyrazine by Bacillus subtilis natto

LIU Xiao-jie，ZHANG Hai-feng，CHEN Ji-cheng，WENG Yu-hui，CHEN Qi-he*，HE Guo-qing
（Department of Food Science and Nutrition，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China）

lt is reported that Bacillus subtilis natto had the ability to synthesize methypyrazine（TMP），but there is no profound investigation.The aim of this paper was to study the impact of the composition of culture medium in liquid fermentation，the addition time and the amount of acetoin，the inoculum level of Bacillus subtilis natto on the formation of TMP in solid-state fermentation.Results showed that liquid medium composed of 20%of soybeans soaked material，0.5%acetoin was the most beneficial to the synthesis of TMP.The highest TMP yield was obtained when acetoin was added in 84h culture time.The synthesis of TMP has positive coorelation with the adding dosage of acetoin，whereas has negative relation with the inoculum level of Bacillus subtilis natto.

TMP；Bacillus subtilis natto；ACT；biological synthesis

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-0187-03

2009-10-21 *通讯联系人

刘晓杰（1986-），女，硕士研究生，研究方向：生物代谢工程。

国家科技部“十一五”支撑计划项目（2006BAD27B09）。