DNA芯片鉴定分枝杆菌的研究

黄明翔,王 琳,张丽水,戴腊梅,张俊仙

2.解放军第三 O九医院全军结核病研究所,北京100091

目前国内外发现的致病性、非致病性非结核分枝杆菌(Non-tuberculosisMycobacterium,NTM)种类多,某些NTM对AIDS患者可能引起比正常人更严重、更广泛的播散病理表现〔1-2〕。因此,准确地鉴定分枝杆菌(Mycobacterium)菌种对于结核病或NTM病的诊断、治疗和控制具有重要意义。

本研究以以传统的菌种鉴定方法为对照,应用DNA芯片对134株分枝杆菌分离株进行菌种鉴定,以期为临床提供快速、简便、准确、有效的菌种鉴定方法,为分枝杆菌病的诊疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源 源自本院2005年5月至2006年12月门

诊及住院肺结核患者。肺结核诊断标准按WS 196-2001结核病分类〔3〕。

1.2 标本前处理 在痰瓶中加入6%的NaOH 20mL,充分混匀后,倒入专用离心管中,置震荡器上震荡15min,待痰液完全消化后,加入25mL生理盐水缓冲后置于4 000r/min离心机中离心20min。

1.3 分枝杆菌培养 美国BD公司BACTEC MGIT 960全自动分枝杆菌检测仪培养,有菌落生长并经抗酸染色为分枝杆菌者进一步做药物敏感性试验和菌种鉴定。

1.4 分枝杆菌传统菌种鉴定 从BACTEC MGIT 960全自动检测仪中挑取分枝杆菌菌落分别做对硝基苯甲酸(PNB)生长试验、噻吩-2-羧酸肼(TCH)、耐热触酶试验〔4〕。

1.5 DNA提取 采用解放军第三O九医院全军结核病研究所制备的标本前处理试剂盒提取 DNA,置-20℃保存备用〔5〕。

1.6 PCR-DNA膜芯片鉴定分枝杆菌菌种 采用解放军第三O九医院全军结核病研究所制备的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒检测上述临床分离株,制备的基因芯片点阵见表1,根据试剂盒说明书进行实验操作〔5〕。若某探针的杂交信号强于其它探针,为该探针杂交阳性,并可判定该菌株为此特异探针相对应的菌种。

2 结 果

2.1 DNA芯片鉴定结果 通过传统的分枝杆菌鉴定和DNA芯片检测技术检测、鉴定了134株分枝杆菌分离株,两种方法鉴定结果一致和基本一致共112株,吻合率为83.6%(112/134),结果见表2,图1。

表1 分枝杆菌菌种鉴定膜芯片的点阵Tab.1 DNA Chip of Mycobacterum

表2 通过传统的菌种鉴定和DNA膜芯片检测134株分枝杆菌临床分离株的结果Tab.1 Identified of 134 Mycobacterum by traditional Identification and DNA Chip

图1 应用DNA膜芯片检测分枝杆菌临床分离株的代表性结果Fig.1 Identification of chinical mycobacterium with DNA chip

3 讨 论

据目前所知,自然界中有致病性和非致病分枝杆菌(Mycobacterium,M.)200多种,其中除结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌等外,其余统称为非结核分枝杆菌(Non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)〔6〕。全国一项调查表明〔2〕,在 441 例痰培养分枝杆菌阳性病例中,经过菌种鉴定,含牛结核分枝杆菌在内的结核分枝杆菌复合群为88.9%,其中真正属于结核分枝杆菌者只有86.4%,而11.1%为非结核分枝杆菌。福建非结核分枝杆菌的比例则更高(13.3%)〔7〕。NTM 肺病在临床症状、肺部 X线影像常与肺结核相似,同样也可以在痰涂片抗酸染色检验时发现阳性。但其中绝大多数对抗结核药物并不敏感,往往导致治疗失败。因此,对分枝杆菌的快速菌种鉴定对结核病诊疗具有极为重要的意义。传统的分枝杆菌鉴定方法费时、费事,且准确率和可重复性差。

1996年美国Affymetrix公司成功地首次应用于实验室试验的生物芯片以来,世界各国在这方面的研究已获得快速进展且有新的突破。我国在应用DNA芯片于分枝杆菌检测和菌种鉴定方面都有新的突破,本研究结果证明用DNA芯片检测技术,可以简便、快速、灵敏、特异地将大多数分枝杆菌鉴定到种,为临床提供正确的诊疗依据。〔8-9〕

本研究以BACTEC MGIT 960培养鉴定法作对照,采用解放军第三O九医院全军结核病研究所制备的分枝杆菌菌种鉴定试剂盒(基因芯片技术)对临床分离的134株分枝杆菌培养物进行了菌种鉴定,两种方法鉴定结果一致和基本一致共112株,吻合率为83.6%(112/134),能够快速的进行菌种鉴定。但由于还存在芯片中标准菌株的数量和种特异DNA标志物等原因,培养法鉴定为戈登分枝杆菌5株、胞内分枝杆菌3株、龟分枝杆菌2株、蟾分枝杆菌、耻垢分枝杆菌和浅黄分枝杆菌各1株等菌种,芯片法未能作出明确的鉴定。因此,该芯片技术还有待于进一步完善。

(感谢吴雪琼教授的指导)

〔1〕中华人民共和国卫生部.1990年全国结核病流行病学抽样调查资料汇编〔C〕,1992,3：60-65.

〔2〕全国结核病流行病学抽样调查技术指导小组.2000年全国结核病流行病学抽样调查报告〔J〕.中国防痨杂志,2002,24(2)：102.

〔3〕中华人民共和国卫生部.中华人民共和国卫生行业标准〔M〕,WS 196-2001结核病分类,2001-07-20.

〔4〕张丽水,黄明翔,戴腊梅.应用 BACT ECTMMGIT 960全自动分枝杆菌检测系统对特殊标本的检测〔J〕.中国人兽共患病杂志,2004,20(12)：1238-1239.

〔5〕梁建琴,吴雪琼,张俊仙,等.应用聚合酶链反应-膜芯片技术快速鉴定分枝杆菌菌种〔J〕.河北医科大学学报,2004,25(5)：289-292.

〔6〕汪小平,张天民.新发现的非结核分枝杆菌研究进展〔J〕.中国防痨杂志,1999,21(3)：175-176.

〔7〕刘坦业,江秀文,俞文诚.福建省非结核分枝杆菌感染流行情况〔J〕.中国人兽共患病杂志,1995,11(1)：53-55.

〔8〕刘金伟,匡铁吉,王金河,等.分枝杆菌鉴定方法的比较研究〔J〕.中华结核和呼吸杂志,2000,23(10)：631.

〔9〕张俊仙,吴雪琼,邢婉丽,等.应用 DNA 微阵列技术快速鉴定分枝杆菌菌种〔J〕.中国防痨杂志,2007,29(1)：1-7.