广州管圆线虫特异性基因的检测*

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广州管圆线虫病是一种人兽共患的食源性寄生虫病,近年来由于广州管圆线虫中间宿主福寿螺、褐云玛瑙螺的大量繁殖和饲养,加上人们饮食上风糜生猛鲜活与猎奇,导致广州管圆线虫病相继在各地暴发或散发流行,已被列入新发感染性疾病〔1〕,虽然脑脊液中查见虫体是该病确诊的依据,但是检出率极低,影响广州管圆线虫病的治疗及效果〔2〕。因此,开展广州管圆线虫病的分子生物学研究并探讨有效的诊断方法,不仅有应用价值同时也为其它疑难寄生虫的诊断方法提供新的研究方法。

1 材料与方法

1.1 虫体材料 从采集的福寿螺中分离出广州管圆线虫Ⅲ期幼虫,经将分离出来的广州管圆线虫Ⅲ期幼虫按每只70条幼虫的数量经口感染大白鼠5只。感染36d后,在鼠粪中检获Ⅰ期幼虫。在感染70d后解剖大白鼠,获取广州管圆线虫的成虫虫体,并从鼠肺中分离虫卵。其它各种虫体如肝毛细线虫、钩虫、鞭虫、鼠蛲虫和绦虫等由本科室在防治过程中收集。

1.2 仪器与试剂 PCR扩增仪;凝胶成像仪;2×Tap PCR MasterMix、DNA Marker等上海生工生物技术服务有限公司产品。

1.3 DNA提取 将准备好的样品加生理盐水2mL,于玻璃匀浆器中匀浆,再将匀浆液倒入2mL塑料离心管中,加20μ L蛋白酶K,再加SDS至终浓度为1%,上下颠倒混匀后,置混合液于55℃水浴,水浴时间2.5h;水浴完毕后,向匀浆液中按1∶1比例加酚/氯仿/异戊醇混合液(25∶24∶1),轻轻震荡混匀5min,12 000g离心5min;吸上层水相 800μ L于一灭菌塑料离心管中,加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,轻轻震荡混匀5min,12 000g离心5 min;吸上层水相500μ L于一塑料离心管中,加入两倍体积的无水乙醇,放置液氮中5min,取出后12 000g离心5min,沉淀DNA,倾去上清液;于沉淀中加入75%乙醇溶液500μ L,轻轻混匀后 12 000g离心5min,倾去上清液,室温凉干;再向DNA沉淀中加200μ L TE缓冲液,-20℃保存备用。

1.4 引物设计与合成 通过GenBank检索有关广州管圆线虫的基因,获得大亚基rRNA基因部分序列,参照文献设计引物为AC(P1)：5'-TGATGCTTGTGCGGTTTTCG-3'和 AC(P2)：5'-TTCCCTTGGCTGTGGTTTCG-3',引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。

1.5 PCR扩增 PCR反应体系的总体积为20μ L,其中2×Tap PCR MasterMix(组成为0.1U Taq Polymerase/μ L;500 mol/L dNTP each;20 mol/L Tris-HCL(Ph8.3);100 mol/L KCL;3 mol/L MgCl2;其它稳定剂和增强剂)10μ L,引物(10 umol/L)各0.4μ L,广州管圆线虫各期虫体DNA 溶液2μ L,加水至20μ L。PCR反应条件为：95℃5 min;94℃50 s,55℃45 s,72℃50 s,30个循环;72℃10 min。

1.6 产物的检出与序列测定 取6μ L PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。PCR产物由上海生工生物技术服务有限公司进行序列测定。

1.7 特异性检测 以广州管圆线虫成虫DNA为对照,按1.3中提取虫体方法提取取肝毛细线虫、钩虫、鞭虫、鼠蛲虫和绦虫DNA,进行PCR扩增,经2%琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR产物,以检测其特异性。

2 结 果

2.1 PCR扩增 用引物AC(P1)和AC(P2)扩增广州管圆线虫各期虫体DNA,结果如图1。PCR产物大小约为400bp,与设计大小一致。

图1 广州管圆线虫虫体PCR扩增结果1：成虫;2：Ⅲ期幼虫;3：Ⅰ期幼虫;4：虫卵;5：对照;M ：DNA MarkerFig.1 Result of Angiostrongyluscantonensis test by PCR1 Adult worm;2：Third-stage larva;3：First-stage larva;4：eggs;5：control;M ：DNA Marker

2.2 PCR方法的特异性 用广州管圆线虫大亚基rRNA片段基因引物对肝毛细线虫、钩虫、鞭虫、鼠蛲虫和绦虫DNA,进行PCR扩增,结果未出现阳性扩增条带。(图2)。

图2 特异性检测结果1：广州管圆线虫;2：肝毛细线虫;3：钩虫;4：鞭虫;5：鼠蛲虫;6：绦虫;M：DNA MarkerFig.2 Result of specificity test by PCR1：Angiostrongyluscantonensis;2：Capillaria hepatica;3：Necatoramericanus;4：Trichuris trichiura;5：Syphacia obvelata;6：Hymenolepis nana;M ：DNA Marker

2.3 序列测定结果 扩增产物测序结果如下：

上述DNA大小为421bp,测序结果与被扩展的广州管圆线虫目的基因序列一致。

3 讨 论

广州管圆线虫是引起人体嗜酸性粒细胞增多性脑膜炎或脑膜脑炎的重要病原体,世界各地均有病例报告,并有多起集体暴发的报道〔3〕。近年来我国广州管圆线虫病有增多的趋势,福建省也有多起集体暴发和许多散发病例〔4〕。因广州管圆线虫病的病原体不易诊断,国内外学者为寻求简易、灵敏的诊断方法,对广州管圆线虫病诊断技术进行较多研究,已见报道的广州管圆线虫病血清免疫学检测方法有IHA、ELISA、Dot-ELISA、免疫酶染色试验(IEST)、间接免疫荧光法(IFAT)、间接凝胶凝集试验(GPAT)、免疫PCR(Immuno-PCR)等7种,有的灵敏度高,但操作复杂,最简易快速的Dot-ELISA检测,也需3 h出结果〔5-7〕。

近年来也有许多关于广州管圆线虫基因检测方面的报道。PCR是公认的敏感和特异的检测方法,对感染性疾病具有较好的诊断价值。广州管圆线虫的大亚基rRNA基因是细胞中含量最多,且结构保守,编码为多拷贝的基因,易于检测发现,具有诊断的价值〔8〕。并且有开展检测螺体内广州管圆线虫幼虫研究的报道〔9〕。广州管圆线虫幼虫侵入人体的中枢神经后,绝大部分幼虫不再继续发育而停留在脑部,被机体或者药物清除,因而要在脑脊液查出幼虫的几率极低,但脑脊液中含有广州管圆线虫的残留物的可能性很大,因而极可能在这些残留物中检测出广州管圆线虫的rRNA基因片段,从而证实机体被广州管圆线虫感染。本实验证实广州管圆线虫各期虫体的大亚基rRAN基因序列具有较好的特异性,易于检测,对于诊断脑脊液中是否有广州管圆线虫残留物有一定的意义,本研究工作将在这方面继续进行探讨。

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