口蹄疫病毒与猪水泡病病毒入侵宿主细胞的内化机制研究进展

吉艳红,刘艳红,刘湘涛

口蹄疫病毒与猪水泡病病毒入侵宿主细胞的内化机制研究进展

吉艳红,刘艳红,刘湘涛

口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是猪、牛、羊等偶蹄动物的一种高度接触性传染病,其临床表现以口鼻腔粘膜、蹄部等出现水泡或溃烂为特征,与猪水泡病(swine vesicular disease,SVD)极其相似,常以流行形式发病,对养猪业的危害较大。由于FMD和SVD在临床症状上很难区分,因此给FMD和SVD的诊断带来一定的困难。

口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,FMDV)和猪水泡病病毒(swine vesicular diseas virus,SVDV)的病毒粒子直径大小为26nm-30nm,衣壳是二十面体,由4种结构蛋白(VP1-VP4)组成的60个不对称原粒构成。衣壳蛋白包裹有极性的单股正链RNA分子,构成病毒的基因组。虽然FMDV和SVDV的病毒粒子在结构上极其相似,但是FMDV属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属;SVDV则属于小RNA病毒科肠道病毒属,并且这两种病毒在入侵细胞时的入胞方式、内化途径和依赖的细胞受体有所不同。因此,通过分析这两种病毒入侵细胞途径和病毒在细胞内复制的不同之处,目的是找到更好的防控 FMD和 SVD的策略。本文以SVDV和FMDV在进入宿主细胞的内化作用途径及所用的细胞受体展开综述。

1 FMDV受体及其内化机制

FMDV进入细胞完成病毒粒子的组装、释放,可通过不同的途径,一种是依赖整联蛋白受体介导的内吞作用途径;一种是依赖硫酸乙酰肝素受体介导的内吞作用途径〔1〕。整联蛋白是最早被确认的FMDV受体,是 FMDV进入细胞的决定性因素。整联蛋白为膜内受体家族,它们承担各种细胞功能,包括细胞-细胞粘连和细胞-基质的粘连以及高和低两种亲和状态存在从而将信号传入和传出细胞。每个受体分子都是异二聚体,有2种不同的Ⅰ型穿膜亚单位α和β组成。FMDV最初感染培养的细胞时,至少能够利用4种αV亚群的整联蛋白家族作为受体。FMDV通过VP1的βG-βH环上的高度保守序列精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arginine-glycineaspartic,RGD)与整联蛋白家族的4种受体αVβ1、αVβ3、αVβ6、αVβ8 相互作用。

当 FMDV吸附到细胞表面时,其内化作用与αVβ6整联蛋白有关。有趣的是,αVβ3整联蛋白调控着细胞生长因子,它不参与FMDV内化作用〔2-3〕。细胞内激酶和 GTP酶是内在化酶,它们可以循环到细胞质膜重复利用〔4〕。虽然αVβ6整联蛋白在这一方面还没有进行实验,但是可以肯定的是整联蛋白受体不能回到膜表面重复使用,因为在2h后在膜表面没有检测到整联蛋白,甚至在病毒感染后期也没有检测到整联蛋白。目前还不清楚是否细胞膜表面的整联蛋白利用病毒的内化作用使自身表达下调,病毒抑制了帽依赖的蛋白合成,致使不能合成新的整联蛋白。

最近的研究表明,各亚型FMDV都能够相当高效的利用αVβ6整联蛋白,并且αVβ6在受体结合过程中起活化作用;而利用αVβ3整联蛋白效率较低〔5〕。此外,A型 FMDV在培养的细胞中利用αVβ3和αVβ6整联蛋白作为受体,但是O型FMDV对αVβ6整联蛋白则有高度的亲和力〔6〕。

研究病毒与受体的相互作用,有助于了解病毒感染细胞的具体过程。Barry Baxt等〔7〕利用共聚焦显微镜观察O型和A型FMDV入侵细胞时发现:培养的细胞表达αVβ3和αVβ6整联蛋白,FMDV能够与细胞表面的整联蛋白受体相互作用。当温度为4℃时,FMDV吸附并定位到细胞表面时,但是它几乎不与αVβ6整联蛋白结合。当把温度迅速调置37℃,5m in后病毒粒子定位到网格蛋白,15m in后检测到FMDV衣壳蛋白,这可能与整联蛋白在胞内的构象发生改变、带标记的网格蛋白介导的胞吞作用有关;相反,FMDV不能共定位到带标记的小凹介导的胞吞作用。在温度从4℃转化到37℃1h后,FMDV蛋白出现在细胞核区域周围,且能与整联蛋白相互作用;在温度从4℃转化到37℃15m in时,FMDV蛋白定位到有标记的早期包涵体内,但在晚期包涵体内没有发现病毒蛋白。在温度4℃转化到37℃30min后,基本上没有病毒再定位到网格蛋白,这可能是由于网格蛋白衣壳从细胞质膜上分离到的是没有衣壳的网格蛋白〔8〕。

当FMDV在培养的细胞上适应生长后,该病毒利用细胞表面的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)作为受体,使自身毒性丧失〔9〕。尽管 HS内化作用配体的作用途径还不清楚,但一些实验结果表明 HS-介导的内化作用的生长因子经由小凹依赖的途径〔10〕。因此,FMDV利用这一内化作用途径可以证明受体的功能,并且该功能不是病毒所具有的。

通常情况下,FMDV通过内吞作用途径,且依赖于网格蛋白介导(网格蛋白介导的内吞作用不依赖脂质笩)、小凹介导或者依赖于脂笩介导的机制进入细胞,然后与细胞膜上相应的受体发生作用〔11〕。为了确定FMDV通过内吞作用途径进入细胞,将病毒分布到标记的网格蛋白或小凹途径进行检测。病毒通过受体与胞膜结合部位的受体富集区结合,对应的细胞膜内侧是网格蛋白,此阶段的结合是可逆的。病毒粒子进入细胞通过胞吞作用,形成网格蛋白包裹的吞噬小泡,吞噬小泡很快与核内体融合,再与溶酶体融合。在有莫能菌素存在、吞噬小泡内溶质p H值升高条件下,能够显著抑制 FMDV的复制,病毒蛋白不能释放到能够循环利用的包涵体中,且在内质网或者高尔基体中也没有发现这两种细胞器能够与病毒蛋白发生作用。由此可见 FMDV利用网格蛋白介导的内吞作用途径感染细胞和病毒在胞吞作用形成的酸性介质的吞噬小泡内开始复制,使病毒衣壳发生构象变化,促使其破裂,释放出病毒基因组〔12〕。

虽然FMDV与受体之间的作用关系已经研究得很清楚,但FMDV如何将病毒基因组释放出来的机制还不清楚。肠道病毒和它们受体之间的作用关系能够引起病毒粒子的构象再次发生变化,结果导致VP4的释放和VP1 N-端在一定程度上的伸展,此时已发生变化的病毒粒子称为原粒或A粒子〔13〕。A粒子的出现使细胞膜与80S的作用降低,并且抑制了病毒基因组的释放〔14〕。相反,FMDV与受体的相互作用不能引起病毒粒子构象的变化〔15〕。进一步说,病毒内化事件的发生,致使病毒粒子12S五聚体亚单位下调,结果 RNA被释放出来。细胞内复合物p H值的升高,能够抑制12S五聚体亚单位下调,这说明吞噬小泡的内吞作用发生在酸性环境中〔16〕。有趣的是,吞噬小泡内病毒粒子的下调必需依赖于细胞再次发生感染过程,如果病毒的感染过程不能够再进行,这种下调需要其它的过程才能完成。

总之,易感动物的发病过程是FMDV与细胞表面的整联蛋白相互作用介导的,受体再循环使用通常用来研究病毒的内化作用过程;并且FMDV进入细胞内化方式是通过网格蛋白介导的胞吞作用途径〔17-18〕。FMDV依赖于不同的αⅤ整联蛋白作为表面受体,尤其是位于 IBRS-2细胞αⅤβ8,且这一细胞系目前正在被研究〔19〕。

2 SVDV受体及其内化机制

SVDV通过HS蛋白聚糖作为表面受体感染细胞,利用共同的表面分子:柯萨奇病毒-腺病毒(coxsackievirus-and-adenovirus recep to r,CAR),作为宿主细胞受体。CAR是46kDa的跨膜糖蛋白,具有两个细胞外免疫球蛋白样结构域,它也是腺病毒纤维蛋白的黏附分子。SVDV可以与人的衰变加速因子(decay-accelerating facto r,DA F)结合。当病毒接触细胞后,SVDV病毒粒子使受体的空间构象发生变化,暴露出内在衣壳蛋白VP1 N端部分。SVDV能够与CAR相连而不与DAF相互作用〔20〕,并能与 HS相互作用,其内化途径依赖于发动蛋白、网格蛋白介导的内吞作用途径将病毒转运到早期包涵体。SVDV感染细胞要求包涵体内溶质处于酸性环境,并且病毒的感染过程可以被氯化铵和Concanamycin A抑制。而氯化铵和Concanamycin A抑制病毒感染细胞的途径不同〔21〕。

SVDV的内化作用通过不同的胞吞作用途径来完成。因此,硫酸粘多糖(GA Gs)尤其是乙酰肝素糖原在许多病毒与细胞间的相互作用中起作用。通常,结合有HS的病毒易于吸附到细胞上并与细胞受体结合,Estela Escribano-Romero等〔22〕用亲合色谱法分析了包括肝素和硫酸乙酰肝素在内的几种不同 GA Gs结合SVDV与科萨奇病毒B5的能力,用可溶性硫酸乙酰肝素、肝素和硫酸软骨素B(CSB)处理病毒并用酶消化细胞表面的 GA Gs均可抑制SVDV对IBRS-2细胞的感染。通过分析病毒感染细胞的过程表明,SVDV利用 HS作为受体结合到细胞表面,并且这种情况发生在病毒内化作用前的吸附过程。分析肝素对SVDV抑制作用不敏感的变异株序列表明:有两种不同的氨基酸残基(A 2135V和I1266K)参与肝素/硫酸乙酰肝素的作用。在三维结构模型中,这些氨基酸残基聚集在衣壳外露区,由此可见,SVDV与 GA Gs的结合介导病毒-细胞相互作用的早期阶段,这将有利于其受体(如CAR等)的随后识别。

M iguel A等〔23〕研究表明SVDV内化作用进入细胞的机制可以被网格蛋白介导的内吞作用所抑制,并且病毒的扩散需要经过内质体小室转移。利用电子显微镜观察,可以发现SVDV粒子存在于CCPs内,应用共聚焦显微镜观察发现:在包涵体内可见到被标记的SVDV粒子,并且SVDV感染后可以被药物显著的抑制,且包涵体的p H值升高。在SVDV感染的早期阶段(不是FMDV感染的早期阶段),微管依赖整联蛋白,且SVDV利用胆固醇提取物通过内吞作用进入质膜比FMDV更容易。这一结果表明病毒的感染途径、包涵体内病毒的数量与内化方式有关。

SVDV进入细胞的机理尚未完全弄清,和其他小RNA病毒一样,病毒受体分子的存在是病毒入侵细胞的先决条件,在病毒的感染过程中起着重要的作用。SVDV与其受体相互作用时,其衣壳发生一系列构象改变,VP1 N末端外露,VP4丢失,这些改变导致其结构和抗原性改变,变为A粒子。A粒子是感染早期病毒在细胞内最丰富的形式,似乎是小RNA病毒脱衣壳和将RNA释放入胞浆的必需阶段,但其发生的方式仍然不清楚。

3 结 语

大部分无囊膜病毒通过内吞作用途径进入细胞,其方式有:或者依赖于网格蛋白,小凹介导的作用途径,或者是脂笩介导的途径〔24〕。目前至少有4种不同的小RNA病毒利用整联蛋白受体感染细胞。1型艾柯病毒病毒利用α2β1整联蛋白作为受体〔25〕,通过小凹介导的途径进入细胞〔26〕;但是人的1型双埃柯病毒利用αVβ3或αVβ1整联蛋白作为受体〔27-28〕,利用网格蛋白介导的内吞作用途径进入细胞〔29〕;A 9柯萨奇病毒利用αVβ3整联蛋白作为受体〔30〕和谷氨酸调节蛋白78作为共同受体,且谷氨酸调节蛋白78与Ⅰ型主要组织相容性复合体与依赖于脂笩介导的病毒内化作用有关〔31〕。FMDV和SVDV的1型小窝蛋白磷酸化需要各自胆固醇,并且药物(制霉菌素、菲律宾菌素、洛伐他汀)能够影响小凹介导的途径,但是并不影响病毒的感染,这表明胆固醇与小凹功能无关。SVDV内化作用依赖于动力包涵体。早期包涵体的过程可能始于细胞质膜CCP作为配体的报告,然后分别进入不同的CCP,这就大大降低了竞争多种内吞作用途径。比较FMDV与SVDV的内化作用途径表明:这两种病毒都通过内涵体途径、网格蛋白介导的内吞作用途径进入细胞,只是 FMDV利用αV整联蛋白作为受体;SVDV利用 HS作为受体。通过对 FMDV和SVDV入侵细胞及内化机制的研究,将有利于研究阻断病毒复制的通路,并为寻找新型抗病毒药物提供可靠的靶位点。

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1002-2694(2010)11-1075-03

S852.6

A

刘湘涛,Email:hnxiangtao@hotmail.com

中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,国家口蹄疫参考实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,兰州 730046

2010-05-30;

2010-08-31